Persisters的研究进展及清除策略

1、    persisters的研究进展及清除策略    康佳宁摘 要：persisters是野生型细菌的一种表型变异，对抗生素具有高耐受性的休眠的细胞亚群，通过减少其新陈代谢并进入休眠状态从而在抗生素治疗中存活下来，并在抗生素去除后恢复生长，是造成抗生素治疗顽固性和感染性疾病复发的主要原因之一。本文将对persisters的生物学特征、产生机制以及清除策略等内容作一综述。关键词：persisters;毒素抗毒素系统;抗菌机制persisters这个概念是1944年都柏林大学医学博士bigger首次提出的，他在研究青霉素杀死金黄色葡萄球菌的过程中发现，大部

2、分细菌都被杀死但总有一小部分细菌培养物（约占细菌种群的1%）存活下来，存活下来的这部分细菌可以重新增殖并對青霉素保持相同的敏感性，为了与传统意义上的耐药菌相区分，他将这部分细菌命名为“persisters”。与众所周知的由基因突变或水平基因转移引起的抗生素耐药性不同，persisters并没有遗传上的改变，最小抑菌浓度（mic）不会增大，这种不发生任何抗性基因突变、仅以非增殖小亚群形式耐受抗生素的现象称为“persistence” 1。persisters的特点可概括为低活性、多药耐受、短暂表型性和生长异质性。休眠的persisters不会影响药物与相应靶点的结合，但由于其低下的代谢活动，会导

3、致抗菌药物无法发挥杀菌作用，因而具有多种药物耐受的特性。1 persisters的产生机制persisters形成机制不遵循复杂细胞功能的单个线性调节途径的控制，它的形成机制比较复杂，受多种机制的调控，既可以自发随机产生，又可以在环境压力下诱导产生，目前对persisters的形成机制尚无定论，但普遍认为与营养限制、抗生素治疗、ppgpp（鸟苷四磷酸）调控、毒素抗毒素系统（ta系统）、代谢调节等有关系。1.1  营养限制微生物在营养缺乏条件下生理机能将发生相当大的变化，这种变化发生在微生物群体生长的稳定阶段。有文献表明，细菌培养物在进入稳定期后开始积累persisters细胞。营养饥

4、饿会触发persisters形成，例如，当培养基中的氨基酸或氮缺乏，部分细菌会进入persisters状态，导致抗生素治疗失效2。1.2ppgpp调控鸟苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，ppgpp）作为胞内信号分子，介导细菌对环境胁迫产生的应激反应，是ta 系统的效应物质，主要参与细菌基因转录的调控。响应特定的压力，spot和rela被激活以合成核苷酸警报蛋白ppgpp。增加的ppgpp水平通过抑制胞外磷酸酶（ppx）导致无机多磷酸盐（polyp）的积累，降低polyp。积累的polyp与lon蛋白酶优先结合，以裂解抗毒素hipb，导致过量的毒素hip

5、a。作为回报，游离的活性毒素hipa通过其atp结合位点ser239的磷酸化使gltx失活，结果是不带电荷的trna带有谷氨酸（trnaglu）在细胞中积累。不带电荷的trnaglu负载在空的核糖体位点，并触发rela激活更多ppgpp合成，从而促进细胞进入休眠状态形成persisters细胞3。1.3ta系统毒素 - 抗毒素系统位于质粒上，其编码能够抑制细胞生长的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生长条件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在应激条件下，抗毒素被选择性降解，释放毒素以抑制必需的细胞过程，如dna复制和蛋白质翻译，从而导致生长停滞。ta系统在细菌耐药性和persister形成中发

6、挥重要作用。目前根据它们对应的抗毒素的蛋白质组性质及其不同的调节机制将ta系统分为六类，被称为i-vi型ta系统。在i型和iii型ta系统中，抗毒素是非编码rna;在ii型，iv型，v型和vi型ta系统中，抗毒素是一种蛋白质。ii型ta系统是目前研究最多的，i型，ii型和v型，涉及persister的形成4。i型ta系统具有非编码rna抗毒素和蛋白质毒素。在这个系统中，小分子反义rna（srna）与毒素的mrna碱基配对以抑制其翻译。在正常生长条件下，这种双链体抑制核糖体结合，并且迅速被rnase iii降解。然而，在应激条件下，抗毒素srna库减少，导致现在非双链体毒素mrna的翻译。ii型

7、ta系统是最大和研究最多的ta系统类，在大多数自由生活细菌中鉴定出数千个ii型ta基因座。ii型ta系统抗毒素和毒素都是蛋白质，抗毒素通常具有两个结构域，一个结合dna，另一个结合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素两个基因的表达是由ta复合物在转录水平上调控的，该复合物涉及到启动子区域与回文序列的结合（抗毒素和大多数情况下ta复合物都结合ta启动子以抑制转录。）。在生长条件下，毒素与抗毒素结合，后者抑制其活性。在应激条件下，活化细胞蛋白酶如lon和clpxp，其优先裂解抗毒素，释放毒素以通过抑制翻译或复制来抑制生长。v型系统中，抗毒素（ghos）是一种rnase（核糖核酸内切酶），在生长条

8、件下裂解毒素（ghot）mrna。在应激条件下，ghos的mrna被ii型毒素mqsr降解。第一个ta基因座tisab-istr-1参与了sos对dna损伤的应答， 该基因座编码一个有毒的基因tisab和两个小rna，即istr-1和istr-2。tisab受lexa控制，并因此受到sos反应的激活，但只有tisb对毒性负责。 istr-2的转录也受sos调节，不参与tisb的控制，而抗毒素istr-1与lexa依赖的启动子结合，并通过诱导tisb mrna的rnase iii依赖性切割来抑制tisb的表达。在没有sos应答的情况下，通过诱导tisb mrna的rnase iii依赖性切割，将

9、istr-1组成性转录为灭活tisab的毒性。当环丙沙星引起dna损伤时，它会激活reca蛋白，从而导致lexa阻遏物裂解，然后引发sos反应。控制lex启动子的抗毒素istr-1几乎被完全裂解，而毒素tisb逐渐积累并迅速结合到细胞质膜上，导致膜损伤，质子动力（pmf）和atp水平降低。这导致dna，rna和蛋白质合成的速率降低，并且阻止了细胞吸收药物。结果，生长减慢并形成了耐多药的persisters。1.4代谢调节任何参与细菌物质合成和能量代谢的过程都可能与persisters形成相关，其涉及机制和系统冗繁。lon 蛋白酶参与大肠埃希菌多种抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株对氨苄西林和

10、环丙沙星的persisters水平都降低，过表达lon 蛋白的野生型细菌persisters水平明显升高，然而对于缺失10 个编码mrna 内切酶的ta 基因座的突变株，persisters水平并没有明显变化5。营养缺乏激活lon 或clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，释放hipa、rele 等毒素蛋白。rele裂解mrna 或者通过ppgpp 依赖性信号转导途径诱导细胞生长停滞;hipa 能够磷酸化谷氨酰- trna 合成酶（ glutamyl - trna synthetase，glt x）的293 位丝氨酸并抑制其活性，导致空载glu - trna 增加，激活rela 引起严谨反应，合成pp

11、gpp，导致细菌停止生长。2  清除策略研究发现6抗perpersister化合物根据其作用机理，使用不同的策略杀死persisters细胞。可以通过干扰群体感应（m64），sos响应（lexa3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（no）和严谨反应（relacin）来抑制persisters形成。其他策略包括通过刺激ros的产生（ag +，l-丝氨酸）或刺激细菌的新陈代谢，从而使persisters细胞对抗生素敏感，从而刺激抗生素靶标（c10，顺式-2-癸烯酸）。或者，可以通过改变ph梯度（l-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的摄取（l-丝氨酸，次离子休克，代谢产物）来

12、增加抗生素的摄取。可以通过刺激非特异性蛋白酶活性（adep4，拉霉素），dna交联（丝裂霉素c，顺铂）或膜去极化（硼霉素，ht61，nck-10）来直接杀死persisters细胞。直接杀死persisters细胞的最常见策略是通过广泛破坏细菌膜。3 展望由于目前针对persisters形成机制研究的目标菌主要集中在大肠埃希菌，对于其他的细菌持留状态研究较少，因此，需要加强对其他细菌持留状态的研究，以进一步明晰不同细菌的持留机制是否具有保守性或差异性。寻找转化persisters的药物是控制慢性感染的关键，未来我们可以在中药或者天然化合物中寻找能够促进persisters向药物敏感状态转化的物

13、质，根据persisters产生的机制寻找药物有效的作用靶点，也可以尝试研究联合用药先将persisters转化为抗生素敏感状态，再利用抗生素彻底消灭的方法。参考文献：1bigger jw. treatment of staphylococcal infections with penicillin. j.lancet 1944;244：497-500.2brown dr.nitrogen starvation induces persister cell formation in escheridhia coii.j.bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.3rock

14、er a，meinhart a.type ii toxin：antitoxin systems.more than small selfish entities.current genetics，2016，62（2）：287-290.4równicki m，pieko t，czarnecki j，et al.artificial activation of escherichia coli mazef and hipba toxin-antitoxin systems by antisense peptide nucleic acids as an antibacterial str

15、ategy.frontiers in microbiology，2018，9：2870.5maisonneuve e， shakespeare lj， jorgensen mg， et al. bacterial persistence by rna endonucleases j . proceedings of the national academy of sciences of the united states of america， 2011， 108（32）：13206 - 13211.6conlon bp， nakayasu es， fleck le， et al. activated clpp kills persi