第八小组 电泳

1、 electrophoresis 415宿舍 2 随着电泳技术不断发展和更新，其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值，相信随着该技术的不断发展必将越来越受到大家的青睐。 早期的电泳技术是由Svedberg教授提出的，1937年，ArneTiselius教授分离出了马血蛋白，开创了电泳技术的新纪元。 此后，各种电泳技术及仪器相继问世，使它在生物化学实验技术中占重要地位。 它主要用于分离各种有机物和无机盐；也可用于分析物质纯度，还可用于分子量的测定，可用于实验室生产，甚至于微生物和细胞的研究。 3一， 概 念及原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。电泳技术

2、：依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同，因而在电场介质中移动的速度不同，从而使其分离的技术4 二， 分类 自由电泳（缓冲液）Tisa-leas式微量电泳显微电泳等电聚焦电泳等速电泳密度梯度电泳区带电泳（有支持体）滤纸电泳薄层电泳垂直板.平板.柱管状凝胶电泳（琼脂、聚丙烯酰胺凝胶）5 补充a等速电泳 加有领先离子和终末离子的样品，电泳后达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。 由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的，且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。 b高效电泳色谱法 是将凝胶电泳解析度和快

3、速液相色谱技术溶为一体，在从凝胶中洗脱样品时，连续的洗脱液流载着分离好的成分，通过一个连机检测器，将结果显示并打印记录。 具有凝胶电泳固有的高分辨率，生物相容性的优点，又可方便地连续洗脱样品。C毛细管电泳 即微柱胶电泳，是将毛细管浸入凝胶混合液中，然后将其揿入代用粘土封闭管底，用一支更细的毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后，除去水层并加蛋白质溶液于凝胶上，毛细管的空隙用电极缓冲液注满，切除粘土部分即可。 6三，影 响 因 素1电泳介质的pH值 溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢

4、。2.缓冲液的离子强度带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。低离子强度时，迁移率快，但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定.反之，但电泳谱带要比低离子强度时细窄。 3.电场强度 电场强度对电泳速度起着正比作用，一种是高压电泳,电压在5001000V或更高.时间短, 适于低分子化合物的分离，而常压(100500V)电泳，产热量小，室温在1025， 标本不被破坏，无需冷却装置。4.电渗现象 在电场中,液体对于一个固体的相对移动称为电渗. 带电粒子的移动距离也受电渗影响；如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距离加上电渗的距离.7核 酸 电 泳 方法 应用DNA 测序（变性

5、PAGE） 基因组分析DNA 分离（非变性琼脂糖凝胶电泳） DNA 片断或PCR产物分离DNA 脉冲场分离(非变性琼脂糖凝胶电泳) 大分子染色体DNA 分离8 A 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳v v设备与试剂： v 水平型可制低浓度凝胶，且制胶与加样都较方便，故应用较广泛。v（2）制胶：v 用缓冲液配制琼脂糖凝胶溶液，快速地彻底融化，冷至55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/ml，然后将其注入玻璃模子中，厚度依样品浓度而定。 注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。v样品制备与加样： v 溶解于TBE或THE内的样

6、品应含指示染料（溴酚蓝或桔黄橙），也可使用2.5Fico 增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10lv电泳： v 一般电压为5-15V/cm。对大分子可用电压5V/cm。最好在低温条件下进行。v 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳. v染色：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色。9样品回收： 电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法等，但各种法都仅仅有利于小分子量DNA片段（1kb）的回收，随着DNA分子量

7、的增大，回收量显著下降。 （6）影响因素 凝胶。电泳液。电压、检测手段，电泳时间 迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响。 （7)用途 适用于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化， 常用于检测和分离同工酶及其亚型，大分子核酸等。 判断扩增片断的大小。 回收扩增片断。用于转印进行Southern印迹10B 脉冲电泳凝胶电泳脉冲电泳凝胶电泳(PFGE) 1112A 纸 电 泳v1)纸电泳 v 就是把样品以带状加在滤纸内来检测其移动和分离的方法。v常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸及稀土元素的分离等。 v2)仪器装置 可分为低压电泳和高压电泳两类。v3)操作v（1） 取

8、色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60烘箱烘干备用。可按需要裁剪，并在距长度方向一端58cm处划一起始线，每隔2.53cm处做一记号备点样用。 v(2) 点样 有湿点法和干点法。 v(4) 电泳 v 于电泳槽中加入适量枸橼酸盐缓冲液(pH3.0),浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为1820V/cm，电泳约1小时45分钟，取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。 v(5) 含量测定 v 剪下样品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，v分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml

9、，摇匀，v放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或v离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，v并按吸收系数计算含量。13 B 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 (SDS-PAGE): 定义及定义及原理 蛋白质电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 SDS是阴离子去污剂，使氢键、疏水键打开，巯基乙醇使P二硫键还原，并结合成P-SDS，所带的相同密度负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。操作要点操作要点1 凝胶制备： 丙稀酰胺（单体）N,N-甲叉双丙稀酰胺（催化剂） 聚合 催化剂： 过硫酸铵四甲基乙二胺（TEMED） AP提供自

10、由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行； 交联剂； 能在线型分子间起架桥作用从而使多个线型分子相互键合交联成网络结构的物质。 常用 过氧化二异丙苯(DCP）过氧化苯甲酰(BPO)(DTBP） 制胶缓冲液： 浓缩胶是大孔胶，缓冲液为pH6.7。有堆积作用，凝胶浓度较小，把较稀样品加在浓缩胶上，可使其被浓缩至一个狭窄的区带。 分离胶是AP催化聚合成的小孔胶，缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 142 样品处理及加样上样缓冲液是Tris-Hcl，DTT，

11、SDS，溴酚蓝和甘油。3电泳（电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液） 开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质一起向正极移动，电泳开始时氯离子泳动率最大，在后面形成低电导区，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成稳定的界面，使蛋白聚在移动界面附近，浓缩成一中间层。 它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶后，分子筛作用使其按各自分子量的大小而被分离。4 染色与固定5 脱色与 分析应用； 测定蛋白质分子比较成功；用于蛋白质定量； 用做蛋白质纯度的鉴定；分离蛋白质和寡糖核苷酸 测定样品P含量：扫描定量（比色）15 C 等电聚焦等电聚焦（IEF）

12、基本原理 电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。2.操作 1）稳定的pH梯度的形成： 一种是人工pH梯度.不稳定，重复性差，现已不再使用。 另一种是天然pH梯度。在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，电泳前，各段介质中的pH相等，用pH0表示。 2） 两性电解质载体 （由多乙烯多胺与丙烯酸制备） 3） 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）4）聚焦电泳5）检测3 .特点 优点：分辨率高

13、，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。 16 D 双向电泳双向电泳 IEF/SDS-PAGE1， 第一向第一向IEF等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（管柱管柱） 加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40，使蛋白质按照等电点的不同分开，还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展2 . 第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳 （ 平板）平板） 将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液中振荡平衡，然后包埋在凝胶板上端，即可3.应用应用 可结合质谱对细胞进行蛋白质组的研究，可用于分析环境变化时细胞增殖、分化等过程中的基因表达产物。 最大优势在于它可对一系列复杂的蛋白质进行分析，其斑点的矢量图亦被经常使用。如翻译后的修饰和加工的变化与疾病的发生相关，若一个蛋白有多个矢量，表明该蛋白