基因工程操作程序

1、基因工程的基本操作程序甘肃漳县一中 理化生组 邓燕 复习引入 新课学习 课堂小结 巩固练习结束语2.DNA重组技术的基本工具有那些，各自的作用和特点是什么？复习：（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀” 能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。 （2）DNA连接酶“分子缝合针” 将双链DNA片段“缝合”起来，催化磷酸二酯键形成。（3）基因进入受体细胞的载体“分子运输车” 能携带外源基因进入受体细胞。1.什么是基因工程？ 基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需

2、要的新的生物类型和生物产品。 返回首页请观看基因工程的基本操作步骤示意，想一想每个步骤所用到的工具和要达到的目的。新课学习：基因工程的基本操作程基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：序主要包括四个步骤：一一、目的基因的获取、目的基因的获取；二、基因表达载体的构二、基因表达载体的构建；建；三、将目的基因导入受三、将目的基因导入受体细胞；体细胞；四、目的基因的检测与四、目的基因的检测与鉴定。鉴定。返回首页为什么要有“目的基因的获取”这一步？ 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 一目的基因的获取一目的基因的获取1 目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因。2目的基因的获取方法

3、：目的基因的获取方法：（1）从基因文库中获取）从基因文库中获取 基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。 构建基因文库的目的： 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。小资料：基因组文库：含有一种生物的所有基因。部分基因文库：（如cDNA文库）含部分基因，可由mRNA反转录而来。PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）利用PCR技术扩增目的基因原理：DNA双链复制原料：模板DNA；RNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后

4、RNA引物与单链相应互补序列结合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。特点：指数形式扩增退回步骤(3)人工合成：人工合成：适用于核苷酸序列已知的较小基因二基因表达载体的构建二基因表达载体的构建 1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。 2基因表达载体的组成：复制原点:即控制复制起始的位点。启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录基因。终止子

5、：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来。标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因。复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因 目的基因：即图中所示插入基因3方法： 选择一定的限制酶分别切割分子运输车和目的基因，是两者有相同的黏性末端，再用DNA连接酶把两者连接。4条件：适宜的限制酶、DNA连接酶、ATP（目的基因、启动子、终止子、标记基因）退回步骤为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？ 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 三将目的基因导入受体细胞三将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞

6、内维持稳定和表达的过程。 导入植物细胞：原理:利用农杆菌（胞内寄生菌）对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达（1）农杆菌转化法：（3）花粉管通道法（2）基因枪法 又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 就是在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA(含目的基因），使目的基因借助花粉管进入受体细胞。导入动物细胞：显微注射法：目的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物导入微生物细胞：Ca2+处理细胞感

7、受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子退回步骤四目的基因的检测和鉴定为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？ 这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。 检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。 检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技

8、术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。返回首页退回步骤小结：小结：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的监测与鉴定1.从自然界中已有的物种中分离出来: 从基因文库中获取、利用PCR技术扩增2.用人工的方法合成要点：用一定限制酶将目的基因与质粒切出相同黏性末端受体细胞种类：动植物细胞、细菌、酵母菌等导入方法： 农杆菌转化法、显微注射法、Ca处理细胞法等2.检测方法：分子检测法和都是DNA分子杂交技术，抗

9、原抗体杂交法形态检测法可根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达1.检测对象：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质返回首页课堂练习：1、下列属于获取目的基因的方法的是（ ）利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A BCD一、选择题：D2.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙

10、述中不正确的是（ ）A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C4. 不属于目的基因与运载体结合过程的是( )A用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端B用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端C将切下的目的基因插入到质粒的切口处D将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增D3下列哪项不是基因表达载体的组成部分( )A启动子 B终止密码C标记基因 D目的基因B5基因工程中常用的受体细胞不包括 ( )A人体细胞 B动物

11、细胞 C植物细胞 D微生物细胞A6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 ( )A基因枪法 B显微注射法 C农杆菌转化法 D花粉管通道法B7.分辨基因工程是否成功是通过 ( )A提取目的基因 B基因表达载体的构建C目的基因导人受体细胞 D目的基因的检测与鉴定8要检测目的基因是否成功的插入了受体DNA中，需要用基因探针，基因探针是指 ( ) A用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的DNA片段DB二、非选择题： 将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免力。右图是与植物疫苗制备过程相关的图和表。 请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 。（3）图1步骤所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤转基因所用的细菌B通常为 。（5）对符合