动物细胞原代培养实验项目指导

1、综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：学握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程屮无菌操作技术, 熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细 胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程是把组织或器官从 动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细 胞的壇殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。原代培养科分为组织 培养法和消化法两种。台盼

2、蓝染色法检测细胞活力的原理：台盼蓝是检测死、活细胞最常用的牛物染色试剂 z-o健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死广的细胞，由于膜的完整性丧失，通透 性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。!1!实验材料:1新生兔2. 大剪了、弯头眼科剪、小铁了、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净 工作台、细胞计数板、0.22 u m细菌过滤器、移液枪、枪尖、pe手套、一次性无菌橡 胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. dmem培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋口酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤(方案)：(如需要学生设计，也要提交一参考方案供论

3、证评审)()dmem培养基的配制1. 将dmem培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gnahco3,搅拌溶解，加入 双抗(100iu/ml),调整ph为7.0,定容至1l,用0.22 u m细菌过滤器过滤除菌，分 装，并用封口膜封口，4°c保存备用。2. 取一定量的配制好的dmem培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。（-）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。（2）预热培养用液：把己经配制好的装有培养液、pbs液的瓶子放入37°c水浴锅内 预热。2. 取样（1）处死新生兔，并用75%酒精浸泡1分钟。（2）

4、移入超净工作台，用含有双抗的pbs冲洗2遍。（3）用手术剪剪取所需部位，置于培养皿中，加适量pbs。（要求学生自己设计所要 分离的细胞种类，如成纤维细胞、肝细胞等。）3. 组织细胞的分离（1）用pbs冲洗实验材料2次。（2）用眼科剪剪成小块（2-3mm3）,并pbs冲洗2次。再用dmem培养液冲洗2 次。（3）用3ml dmem培养液悬浮组织块，并用移液枪转入细胞培养瓶。（4）轻轻晃动培养瓶，使组织块均匀的铺于瓶壁，翻转培养瓶（瓶口向下），拧紧瓶 盖，放入二氧化碳培养箱，并拧松瓶盖。（5）35小吋后，补加2ml培养液，瓶口向上继续培养。4. 培养条件37°c、5%二氧化碳、饱和湿度。（三）培养细胞的增殖及活力测定细胞培养24h观察组织块贴壁情况，以后每隔48h观察细胞形态，并换液。细胞 呈现接触抑制后，用台盼蓝染色法检测细胞活力。1. 用移液枪将细胞培养瓶中的培养基取出，并用预热的pbs液洗涤细胞2遍。2. 加入预热的0.25%朕蛋白酶至刚没过细胞，放入37°c消化3min,加入6倍体 积的含血清培养基终止消化，并移液枪反复吹打细胞，将细胞移入离心管，loooipm, 离心5min,加2ml预热的pbs液悬浮细胞，即得细胞悬液。3. 取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。4. 取适量细胞悬液加等体积台盼蓝，