肺表面活性蛋白B在新生儿呼吸窘迫综合征中的作用

1、肺表面活性蛋白b在新生儿呼吸窘迫综合 征中的作用【关键词】肺表面活性蛋白b新生儿呼吸窘迫综合征新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome of newborn, nrds)是引起新生儿呼吸衰竭的主要疾病，也是新生儿特别是早 产儿死亡的主要原因。其发病主要机制是由于缺乏肺表面活性物质 (pulmonary surfactant, ps),导致肺泡表面张力增加,肺泡塌陷。 临床医学、流行病学及生物化学都充分证明nrds是一种多因素、 多基因疾病13 o目前认为nrds与ps中肺表面活性物质蛋白(surfactant protein, sp)合成减少有很大的关系

2、,表面活性蛋白b (sp b)是其中最重要的一种，直接发挥降低肺泡表面张力的 作用4 o近年来，一些sp的遗传性变异，尤其是sp b基因变 异，已被证实是nrds病因中的危险因子5 8 o国外研究发现 新生儿sp b减少或缺陷与某些基因突变相关9。1肺表面活性物质ps是指分布于肺泡内具有降低气液界面表面张力的物质，主要由 肺泡ii型上皮细胞合成，具有高度表面活性，存在于被覆肺泡表面 的液体中。其主要生理功能是降低肺泡表面张力，维持肺泡结构之 间的相对稳定，调节肺顺应性，防止肺泡萎陷和肺水肿。ps为磷脂 蛋白复合物，其中磷脂约占90%,主要存在形式为二棕柵酰卵磷脂 (dipalmitoyl ph

3、osphatidylcholine , dppc )和磷脂酰甘油 (phosphatidylglycerol, pg),对降低肺泡表面张力有重要作用。ps中与磷脂分子相互作用的特异性蛋白质称为sp,约占8% 10%o迄今为止已发现4种sp,根据发现的顺序命名为sp a、 sp b、sp c、sp d 4种亚型。其中，sp a、sp d为大分子 亲水性sp, sp b、sp c为小分子疏水性sp,它们是ps降低肺 泡表面张力的必需物质。sp促进磷脂向液体表层分布并扩散，疏水 性sp b、sp c功能最强，能独立发挥生理效应，且与sp c相 比，sp b作用更强。2sp b的分子生物学特性及生理功

4、能2sp b分子生物学特性sp b基因(sftpb)位于人类第2号染色体短臂，约9.5 kb, 由11个外显子和10个内含子组成，第11外显子是不可译的。 sftpb编码2 kb mrna转录物，该转录物在去除23个氨基酸组 成的第一信号肽后被翻译成含381个氨基酸的sp b前体蛋白(precursor protein, prosp b),分子量约 42 kdsp b 具有一个典型的疏水性起始序列，使之能顺利通过内质网孔进入加工 处理过程。第129131和311313位氨基酸经糖基化作用，n末端糖基化位点被g.l580c>t清除，使131位苏氨酸被异亮氨酸 取代，再经过

5、由组织蛋白酶h及其它蛋白参与的一系列蛋白水解过 程，去除c 、n 末端的氨基酸，最终形成只有79个氨基酸的成 熟sp b,由第67外显子编码10, 11 osp b的表达具有组织细胞特异性，主要在肺泡ii型细胞合成和 分泌，是以同源二聚体形式存在的疏水性蛋白，由二硫化物连接2 条含有79个氨基酸残基的多肽链组成。每条多肽链含有3个二硫 化物桥：cys8 cys77> cys 11 cys71 > cys25 cys46,每个多肽 链的cys48形成链间二硫键，可维持sp b稳定性。每个sp b分 子拥有45个两亲性的a螺旋结构区，成双反向平行排列，sp b 分子带正电荷。成熟sp

6、b合成后贮存于板层体，其疏水面富含亮 氨酸、异亮氨酸、纟颉氨酸，可与磷脂膜相互作用，共同进入分泌途 径。2.2 sp b生理功能sp| b的主要生理作用为促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子 层，从而降低肺泡表面张力、防止呼气末肺泡塌陷、增加肺顺应 性、促进肺间质液体回流。仅含有sp b和脂质的表面活性物质可 以改善ps缺失肺的压力 容积曲线，并能有效治疗nrds动物模 型的ps缺失。2.2.1促进ps中磷脂吸附 在呼吸过程中，ps磷脂必须快速附着 于气液界面并扩展形成单分子膜，才能发挥降低肺泡表面张力的作 用。而sp b最重要的功能之一就是促进ps磷脂在气液界面的吸 附和扩展。sp b的同源二

7、聚体特性及a螺旋结构使其能够与磷脂 层结合：sp b分子中亲水性的正电荷基团与磷脂分子首端的极性 基团相互作用，而疏水性基团与磷脂分子疏水性的酰基端链相互作 用，从而使磷脂在气液平面迅速扩展，加速处于液下相中的磷脂混 合物在液气界面形成单分子膜，提高肺表面活性磷脂降低表面张力 的作用。sp b的碱性残基在与负离子磷脂的相互作用中也发挥着 重要作用，使sp b还能够促进不饱和磷脂，如pg,从磷脂单分 子膜中挤出(squeeze out),从而使单分子膜中的dppc进一步纯 化而更为浓缩，增强磷脂膜的表面活性。若在体外实验中加入抗 sp b的单克隆抗体，可显著抑制ps的快速吸附，使表面张力增 加。

8、体内实验也显示，给小鼠注射sp b单克隆抗体，或给新生兔 气管内滴注sp b单抗，均可引起严重肺损伤和呼吸衰竭，而给予 非特异性抗血清则不引起肺损害。因此，sp b对于ps系统发挥其 正常的表面活性功能不可缺少。2.2.2参与ps在肺泡内的组装和转化肺泡腔内ps主要有四种结 构形式，即板层体(lamellar body , lb )、管髓体(tubular myelin, tm)、单分了层及大小不等的单层或多层囊泡，这一排列 顺序可能就是ps在肺泡内的转化过程：ps由肺泡ii型上皮细胞合 成后，以lb形式贮存于细胞内。lb以出胞方式分泌入肺泡，在肺 泡表面液体层中转换成高度有序呈网格状的tm,

9、后者进而在肺泡 的液气界面上形成具有表面活性的磷脂单分子层。继之膜纯化、崩 溃为囊泡样结构。因此，tm是表面单分子层的前体。tm形成障碍 必将影响ps发挥其正常的表面活性功能。sp b不仅在表面单分子 膜的形成中有重要作用，而且在lb转化为tm的过程中也是不可 缺少的。体外实验显示，将sp a、sp b、ca2+与磷脂(dppc 和甘油磷脂)混合孵育时，可产生典型tm样网状结构，若除去 sp a或sp b,则不能形成tm样结构，若只加sp a,而无 sp b,则只能形成膜外有8 pm微粒附着的双层脂膜，表明sp b 是tm形成的必需成分。sp b基因缺失鼠的肺内无tm,进一步 说明sp b在此

10、方面的重要性。223 sp b促进ii型肺泡上皮细胞对磷脂脂质体的摄取其作用 机制不详。但对sp c摄取却起抑制作用，提示sp b和sp c 在维持气液界面表面活性方面可能起协同作用。sp b还可作用于 肺泡巨噬细胞的氧化亚氮合成酶，使其水平下降，能减少脂多糖诱 导的肺泡巨噬细胞产生氧化亚氮。3 sp b缺失3sp b基因表达的调节sp基因属发育控制基因家族，在人类妊娠前3刀胎肺中，sp|b 基本不表达，在妊娠1518周时，气管、支气管上皮细胞即可见 sp b mrna和表达蛋白，此后呈进行性增加；在妊娠1324周 内，northern印记分析表明sp b增加达成年肺的50%。在妊娠后 3月内

11、，sp b mrna及其表达蛋白水平与ps磷脂水平升高平行， 合成分泌增加，羊水中可检出这些蛋白。人类sp b基因启动子为 lllbp73bp,结构复杂，其中结 合有甲状腺转录因子1 ( ttf 1 )和肝细胞核因子 32 (hnf 32)。sp b启动子活性依赖于各种因子对启动子上游和 下游区的相互作用。ttf 1作为特异性转录因子，能进入核内结合 sp b基因上游顺式作用元件而实现对sp b基因表达调控。 ttf 1通过基序ctnnag tcaag连接到dna结合位点。 ttf 1结合位点的突变可阻碍ttf 1重组体与dna结合，从而 显著抑制sp b启动子活性，以致sp b蛋口合成减少。

12、hnf 32 也有促进启动子的作用。核因子kb (nf kb)结合位点突变可引 起sp b启动子活性降低40%osp b基因表达也受一些体液因素的调节。sp b基因中 (g/c) ggt (a/t) ca (a/c) nntgt (c/t) ct 片段是可与糖 皮质激素受体结合的共同序列，称为糖皮质激素反应元件 (gre) o sp b基因在5端侧序列的700 bp内含有4个greo糖皮质激素对sp b有单相上调作用，在人胎肺移植培养中 能刺激sp b mrna表达增强，在h820核h441细胞系中也有相 似结果。sp基因中ctgacgtcag片段是与camp调控作用有关 的共同序列，成为ca

13、mp反应元件(cre) o sp b基因的第1内 含子中有cre, camp对sp b表达主要是抑制作用。视黄酸 (retinoic acid, ra)能促进sp b mrna的生成及量的增加 12 o目前，大多数研究均支持ra能够上调sp b基因表达， 具体通过ra| rar轴这一信号途径直接作用于sp b基因。而 且，ra还可以通过增强mrna的稳定性、减慢降解速率来提高 mrna的水平12 o而具有强烈致炎效应的肿瘤坏死因子a (tnf a)可降低人肺腺癌细胞系中sp b mrna水平，具有效 量依赖关系。tnf a的抑制性作用与经蛋白激酶c依赖通路的作 用一致。有文献报道，tnf a对

14、sp b mrna表达的抑制是通过 基因3端非翻译区的顺式作用序列介导的13。3.2 sp b基因突变nogee发现新生儿sp b减少或缺失不仅与肺发育程度相关，也 与基因结构变异有关8。sp b等位基因具有多态性，其突变率 为百万分之三，某些特异位点突变可造成sp b蛋白合成障碍。通 过采用基因克隆和dna测序等基因分析技术，发现这些基因突变 主要分布在sp b基因的前9个外显子上，以第2、4、7外显子分 布尤甚，主要包括无义密码子、错义、移码和剪接位点突变。最常 见的突变是1981年teja k等首先发现的位于sftpb第4外显子的 1549c>gga (121ins2)。这种突变的

15、频率是 1/1 000-1/3 000,约 70% sp b缺失病例与其有关8, 15。这种突变导致移码并在第 6外显子产生提前终止翻译的密码子，生成一种易变rna转录物， 使prosp b及成熟sp b缺乏，并引起sp c前体蛋白的不完全 表达14, 15 o然而，121ins2突变不是sp b缺失的唯一原因。近年来，许多 学者对sp b基因突变进行了大量研究。目前已发现30多种引起 部分或完全sp b缺失的隐性功能缺失性突变8, 14 22 o balland等17发现在第7外显子上存在点突变（r236c） arg236cys （cgctgc）,这种突变没有影响转录或mrna的 稳定性，但

16、降低了 sp b的翻译效率和（或）改变了初始翻译产物 的加工，从而使sp b含量减少。nogce等8通过对32个患 sp b缺失婴儿的两对等位基因进行检测，发现了 15种sp b基 因突变。同时还发现第9外显子包含一些同源序列（ccctg和tg a/g a/g g/t a/c）,它们可能与一些小的插入和缺失有关。另一常 见无义突变位于第4外显子g.1580，使第131密码子中异亮氨酸取 代苏氨酸，清除5 端糖基化位点23。daniel j wegner等24发现 sftpb 中 2958 bp 缺失，即从 g.3103 （3 端 193bp 到第6外显子完）到g.6061 （5 端28 bp到

17、第9外显子开始）， 是目前发现的遗传性sp b缺失中最大的缺失。3.3 sp b缺失发 病机制sftpb基因突变既可能引起sp bmrna的缺失，也可能生成异 常sp b前体蛋白，使蛋白错误加工，从而影响活性sp b的生成25。而sp b或其prosp b调节维持ps内环境稳定的许多方 面，包括处理prosp c、组装lb、形成tm、生成有效的ps薄膜 及表面活性脂质和蛋白的再利用。sp b缺失导致ps结构异常、功 能下降及lb结构的破坏26。用稳定的同位素标记ps前体研究 发现，在体外和患病婴儿中磷酯酰胆碱（phosphatidyl choline, pc） 组分及合成是正常的26 , pg

18、减少，l/s<1.0 （正常 >l5） o电镜下sp b缺失的动物肺泡ii型上皮细胞完全缺乏 lb,这是由于缺乏sp b而导致不能包装ps磷脂成为同心性板层 结构所致27。sp b是肺泡ii型上皮细胞正常组装合成表面活 性脂质和sp c所必需，在sp b缺失时，sp c不能被处理转 变为活性形式。prosp c形成的6 kda产物保留了 prosp c肽氨 基末端侧面12个氨基酸，说明prosp c在处理过程中最后的分裂 没有发生，不能生成成熟sp c,最终导致功能性lb缺乏28 o这种未处理prosp c在体外抑制ps功能并可能由于 sp b缺乏而导致ps功能障碍

19、。因此，sp b缺乏患儿呼吸衰竭 也可能是多因素的，如上述ps磷脂及蛋白的异常加工和分泌、lb 缺乏、sp c缺乏等，而不仅仅是因为缺乏sp bo3.4 sp b缺失临床病理特点1993年报道了第1例家族遗传性sp b缺失，该家族中有3个临 床特征相似的患儿，均为足月儿，都迅速发展成了严重的呼吸衰 竭,其临床及x线摄片均与早产儿nrds相似。随后的人量研究显 示，sp b缺乏是一种常染色体隐性遗传病，通常发生在足月儿， 其生后不久即出现严重的、持续的、进行性的呼吸窘迫，一般在生 后12 h内。胸片表现为弥漫性肺泡浸润、肺泡塌陷、网状颗粒浸润 和支气管充气影。大多都有类似家族史。尽管给予氧气和辅助通 气、ps替代和（或）体外膜式人工氧合法（ecmo）等治疗，