第九章人工合成酵母基因组(一)

1、BAG-TJU人工基因组的设计与合成人工基因组的设计与合成李炳志2014-04 Synthetic Yeast 2.0 Building the worlds first synthetic eukaryotic genome together！Dr. Jef BoekeBAG-TJU第九章第九章 人工合成酵母基因组人工合成酵母基因组李炳志2013-04BAG-TJU 1 酿酒酵母简介 2 酿酒酵母基因组结构特点 3 酵母基因命名法 4 人工设计基因组的原则 5 人工合成基因组的技术第九章第九章 人工合成酵母基因组人工合成酵母基因组BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酵母（Yeast）是一类种类繁

2、多的生物资源，已知有80个属约600多种，数千个分离株。株。 酵母是一类单细胞的真核生物。 它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调控机制。 它既能通过有丝分裂进行无性繁殖 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 域：真核域 界：真菌界 门：子囊菌门 纲：半子囊菌纲 目：酵母目 科：酵母科 属：酵母属 种：酿酒酵母BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 又称面包酵母或者出芽酵母。 在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物。 Morganism 发酵中最常

3、用的生物种类。 细胞为球形或者卵形，直径510m。 同时存在单倍体和双倍体(酵母的优势形态)。BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 芽殖(Budding)：正常繁殖方式BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 芽殖(Budding)：正常繁殖方式BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 有性繁殖：子囊孢子 单倍体可以交配，重新形成二倍体 酵母有两种交配类型，称作a和BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces c

4、erevisiae)酵母细胞生活史BAG-TJU1 酿酒酵母简介 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae） 最符合基因表达的宿主，因此被最早成为基因表达系统的宿主。 已广泛被用来表达各种各样的外源基因。 用酿酒酵母表达的乙型肝炎疫苗（Merck公司），人胰岛素（Novo-Nordisk公司）和人粒细胞集落刺激因子（Immunex公司）都已成为正式上市的基因工程产品。 合成生物学：“细胞工厂”“底盘细胞”BAG-TJU 酿酒酵母是1996年完成全基因组测序，第一个完成基因组测序的真核生物。 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可

5、能约有5800个已知功能基因。2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 酿酒酵母的单倍体细胞含16条染色体，总长度为12Mb，其中第I条最短，第IV条最长。 基因组中没有明显的操纵子结构，有间隔区和内含子。 酿酒酵母染色体基因组中，ORF大约占整个基因组的70%基因间平均间隔为600bp。 酿酒酵母中约4%编码蛋白质的基因含有内含子。2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 染色体结构2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 着丝粒centromere 染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域，由无编码意义的高度重

6、复DNA序列组成。 一般位于染色体的主缢痕或染色体端部，使姐妹染色单体连在一起。 着丝粒种类 短着丝粒（点着丝粒）：约200bp 酵母 区域着丝粒：序列较长（从40kb至几Mb），含有很多重复序列2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 酵母着丝粒2 酿酒酵母基因组结构特点 在酿酒酵母中，所有染色体的CEN序列的长度均大于130bp，由53依次分为CDE-I、CDE-II和CDE-III。BAG-TJU 端粒Telomere 真核细胞内线性染色体末端的一种特殊结构，由DNA简单重复序列以及同这些序列专一性结合的蛋白质构成 在大多数生物中，端粒DNA只由几个碱基组成的DNA重复单位通过串联重复而

7、形成的，长度从20bp至几kb不等。 酿酒酵母端粒DNA长约为300bp，其重复单位为 5 C13A 3 G13T2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 复制起点 酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一小段DNA序列，通常称为自主复制序列（ARS，autonomously replicating sequence ）。 自1979年首次发现酿酒酵母的ARS以来，已在酿酒酵母中发现约有400个ARS，但这些ARS使用频率不同，差异十分巨大。2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 自主复制序列ARS的结构 酿酒酵母中，ARS是长度为100-200bp、富含AT的DNA片段。 根据其在

8、质粒中的稳定性，可将ARS分为A、B、C三个结构域，其中A和B最为重要。 A区：由11bp核苷酸（A/T）TTTAT(A/G)TTT(A/T）组成的保守序列，即ARS共有序列。 B区：位于ARS的3末端，长度约80bp。 C区：结构域位于ARS的5末端，这一结构域也是富含AT，但C结构域之间不具有同源性，也不含共有序列。2 酿酒酵母基因组结构特点BAG-TJU 不同物种基因/蛋白命名法并不相同 大肠杆菌：hisG 人类：p38 酵母：URA3 酿酒酵母基因名称 系统名：基因在染色体上的位置 标准名(Standard Name)：基因功能描述3 酵母基因命名法BAG-TJU 酿酒酵母基因命名原则

9、 URA3基因 系统名：YEL021W 标准名：URA3（URAcil requiring）3 酵母基因命名法Yeast第V号染色体上左臂BAG-TJU 酿酒酵母基因/蛋白质书写原则 基因名 需要斜体 细胞中存在该基因：大写斜体 URA3 细胞中该基因缺失：小写斜体 ura3 或 ura3 细胞中该基因突变：小写斜体带编号 ura3-1 蛋白名称为正体 大写正体：URA3 首字母大写，后两位小写：Ura3 首字母大写，后两位小写，最后加p：Ura3p3 酵母基因命名法BAG-TJU 酿酒酵母基因/蛋白质书写原则 实验室常用酵母野生型菌株 BY4741： MATa; his3; leu2; me

10、t15; ura3 BY4742： MAT; his3; leu2; lys2; ura3 BY4743： MATa/; his3/his3; leu2 /leu2; lys2 /LYS2; MET15/met15; ura3 /ura3 W303a： MATa; leu2-3112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15 3 酵母基因命名法BAG-TJU 酿酒酵母基因信息查询 SGD： /3 酵母基因命名法BAG-TJU 如何确定酵母基因的ORF？ 起始密码子：ATG 终止密码子：UAG,

11、UAA, UGA3 酵母基因命名法 酵母基因组的ORF平均长度为1450bp即483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的ORF (4910个密码子)，还有极少数的ORF长度超过1500个密码子。酿酒酵母基因功能标注：SC1.0计划BAG-TJU4 人工设计基因组原则 4.1 人工改造原理 4.2 删除与移位 4.3 替换 4.4 引入新序列 4.5 SCRaMbLE !BAG-TJU4.1 人工设计基因组原则 利用密码子简并性实现Elements删除删除换位换位替换替换引入引入不变不变RetrotransposonstRNA genesTAG stop codons repl

12、aced by TAALoxP Sym sitesGene orderSubtelomeric repeats(Y&X)Individual synonymous codonsNoncoding regionsIntronsPCRTagsBAG-TJUBAG-TJU4.1 人工改造基础BAG-TJU4.2 删除与移位 基本理念： 优化基因组，减少不稳定和冗余结构 删除 逆转录转座子 端粒重复部分 内含子 移位 tRNA基因BAG-TJU4.2 删除与移位 删除 逆转录转座子 目前推测这类重复序列并非必需部分 还会引起染色体不稳定 亚端粒重复部分(Subtelomeric repeats

13、) 有两类，X和Y(无功能) 引起端粒沉默或染色体分离 Y全部删除，X用更优化的序列取代 内含子BAG-TJU4.2 删除与移位 移位 tRNA基因 在基因组中高度冗余的一类基因 共计275个tRNA基因 仅有47种tRNA 这些冗余基因会造成染色体不稳定 从各个染色体上剔除，专门放在一个新染色体上BAG-TJU4.3 替换 基本理念： 将酵母基因组打造得更便于今后人工操作 终止密码子替换 PCRTags 部分同义密码子替换BAG-TJU4.3 替换 终止密码子替换 将TAG替换为TAA 在正常情况下这两者均将转录为终止密码子 有研究小组构建了一种新型tRNA 当细胞中表达该新型tRNA的基因

14、 TAA将不再作为终止密码子 翻译将继续下去Isaacs, F. J. et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genomewide codon replacement. Science 333, 348353 (2011).BAG-TJU4.3 替换 PCRTagsBAG-TJU4.4 引入新序列 必需基因(essential gene) ： 一些基因在突变时会引起致死表型，这些基因被称为必需基因。张春霆 院士生物信息学家天大理学院建立了酵母必需基因库BAG-TJU4.4 引入新序列 非必需基因： 非必需基因 可以

15、随意缺失的基因 同时缺多个非必需基因也有可能致死 能减到多小？ “最小基因组” “精简基因组” “精简基因集”BAG-TJU4.4 引入新序列 在每个非必需基因前后加入了特殊序列 LoxP Sym sites Cre-LoxP重组酶系统 特异性删除某特定序列的技术 在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。BAG-TJU4.4 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 Cre重组酶 于1981年从P1噬菌体中发现，基因编码区序列全长1029bp。 一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序

16、列被删除或重组。BAG-TJU4.4 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 LoxP（locus of X-over P1）序列： 来源于P1噬菌体 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。 13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。BAG-TJU4.4 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列BAG-TJU4.4 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向方向相反相反，Cre重组酶能导致两

17、个LoxP位点间的序列倒位BAG-TJU4.4 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。BAG-TJUBAG-TJU4.5 SCRaMbLE ! SCRaMbLE： Synthetic Chromosome Rearrangement and Modification by LoxP-mediated EvolutionBAG-TJU4.5 SCRaMbLE ! SCRaMbLE：StrainsMutants with different genetic background and phe

18、notypesDifferent combinations of gene deletionsChanges in genome structure and contentSCRaMbLEPCRTagsDeep sequencing优势：随机进化结合PCRTags，方便定位BAG-TJU5 人工设计基因组的技术 5.1 整体策略 5.2 小片段的人工合成 5.3 小片段组装大片段 5.4 大片段的基因组替代BAG-TJU5.1 整体策略AACTTCGTCAGTATCAGCTTTATCCTTATCACCCACATCAGCCATTAGC60bp OligoOligo750bp building block10Kb DNA chunkBAG-TJU5.2 小片段的人工合成 PCRAACTTCGTCAGTATCAGCTTTATCCTTATCACCCACATCAGCCATTAGC60bp Oli