化验员微生物理论(检验员基础)

1、微生物检测 掌握鉴定点 一、微生物基础知识微生物的共性 细菌的形态结构 细菌的生理结构 霉菌的形态特征 酵母菌的形态特征 菌落总数的概念 测定菌落总数时的培养条件 测定菌落总数的均质条件 菌落计数 菌落计数的计数方法 菌落总数的报告要求 大肠菌群的概念 最可能数的概念 测定大肠菌群时初发酵试验的培养条件 测定大肠菌群时样品均质条件 测定大肠菌群时样品匀液的酸度要求 测定大肠菌群时复发酵试验的培养条件 大肠菌群平板计数 LST培养基的制备 BGLB培养基的制备 结晶紫中性红胆盐琼脂的使用注意点 微生物检测 二、培养基配制培养基的分类 培养基的储藏方法 培养基的实验室制备方法 培养基的使用方法 培

2、养基的质量控制方法 培养基的质量测试 微生物检测 三、无菌操作使用超净工作台的注意事项 无菌操作人员的工作要求 无菌操作的常用设备 无菌操作的过程 常用消毒剂的配制方法 常用灭菌方法 微生物目录一、微生物的基础知识一、微生物的基础知识二、二、培养基的配制培养基的配制三三、无菌操作无菌操作一、微生物的基础知识1 微生物的概念 指肉眼看不见或难以看清的微小生物的总称。 大小：一般小于0.1mm2 微生物类群（按细胞结构分类）（1）非细胞型微生物：病毒与亚病毒（2）原核细胞型微生物：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体、古细菌（3）真核细胞型微生物：真菌（霉菌/酵母菌/蕈菌）、单细胞藻类

3、、原生动物 3.微生物的共性 个体小：小于0.1mm。肉眼不可见。 分布广 ：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等, , 土壤中的数量最多。 代谢强：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重100010000倍的乳糖；产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比食用公牛强10万倍 繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物20分钟内就可以繁殖一代 易变异：耐药性产生的原因 4.微生物在自然界的分布 分布:空气、土壤、水、食物、动植物、人体、用具物品等。 土壤：是微生物生活的最适环境 水：仅次于土壤的微生物分布、定居的第二场所 空气：空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘，这类微生物大多数是腐生性的

4、，还来源于人和动物，它们大多数是通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。5.细菌 定义：细菌是一类细而短，结构简单，细胞壁坚韧，以二等分裂方式繁殖的水生性较强的原核微生物 形态:根据其外形可分为球菌、杆菌、螺旋菌（弧菌和螺菌）三大类。 细菌细胞的基本结构:细胞壁、细胞膜、细胞质、核区。（鸡蛋结构） 细菌细胞的特殊结构（只有某些细菌才具有）: 糖被、芽胞、 鞭毛、菌毛等。葡萄球菌 6.霉菌（霉菌是丝状真菌的俗称） 形态特征：霉菌的营养体由分支和不分支的菌丝构成，许多菌丝相互交织形成菌丝体。菌丝是中空管状结构。7、酵母菌形态特征：形态通常有圆形、椭圆形、圆柱形等。比细菌的单细胞个体

5、要大得多，一般宽约15微米，长520微米。8.微生物的菌落特征：特征：大小、形状、光泽度、颜色、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。透明度等。功能：功能：定义：将单个细菌或其他微生物细胞或一小堆同种细定义：将单个细菌或其他微生物细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面，当它占有一定发展空间，胞接种到固体培养基表面，当它占有一定发展空间，并处在适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖，并处在适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖，并形成肉眼可见的细胞堆并形成肉眼可见的细胞堆鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据9、菌落总数（aerobic plate count） 定义： GB 4789.2-2

6、010：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数 P246：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以1g或1ml或1cm2样品中所含的菌落数量来表示。 测定菌落总数时的培养条件：37C培养48h GB 4789.2-2010：36C1C培养48h2h， 水产品30C1C培养72h3h 测定菌落总数的均质条件 （GB 4789.2-2010） 固体半固体样品：放入盛有磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000

7、r/min均质1min2min，或放入盛有稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min。 液体样品：吸取至盛有磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀10.菌落计数（GB 4789.2-2010）到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04C，但不得超过24h11、菌落计数的计数方法（GB 4789.2-2010）12、菌落总数的报告要求13、大肠菌群 概念 指一群在37C能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌 最可能数（MPN） 基于泊松分布的一种间接计数方法（应用统计学的原理所测定和计算出的一种

8、最近似数值） 测定大肠菌群时初发酵试验的培养条件 36C1C培养24h1h，观察是否产气，产气的进行复发酵实验，未产气的继续培养至48h2h 测定大肠菌群时复发酵试验的培养条件 36C1C培养48h2h 测定大肠菌群时样品均质条件 固体半固体样品：放入盛有磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000r/min均质1min2min，或放入盛有磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min。 液体样品：吸取至盛有磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀 测定大肠菌群时样品匀液的酸度要求 pH值应在6.57.5之间

9、 大肠菌群平板计数与菌落总数方法相似详见GB4789.3-2010或教材P253注意：结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）使用前临时制备，不得超过3h LST培养基的制备BGLB培养基的制备二、培养基的配制1、培养基的分类 根据原料来源不同，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基与天然培养基。 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基 根据培养基的用途，可分为选择培养基、鉴别培养基、加富培养基、基本培养基等。2、已灭菌培养基的保存方法 防尘在卫生条件差的地方贮存，依附在尘埃中的细菌、真菌等会落在培养瓶表面，使用前若不进行表面灭菌处理，在接种时就容易随着气流进入容器，使其受到

10、污染 避光吲哚乙酸等某些物质易见光分解。在光照下，一些培养基添加物的成分也会发生变化。 恒温培养基冷却后，可以将其放在10左右的冰箱中贮藏。在培养基摆放过程中温度不应过高，同时还应避免温度有较大幅度的变化 定期更新培养基不宜长期贮存3、培养基的实验室制备方法和使用方法 制备和使用GB/T 4789.28 2003制备培养基制备培养基1. 计算计算2称量称量3溶化溶化4灭菌灭菌5倒平板倒平板倒平板约约5050防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基4、培养基的质量控制方法5、培养基的质量测试1

11、 外观控制制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发脱水。2 污染控制 从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(无菌试验)，确定无微生物生长方可使用。3 性能测试3.1 测试菌株选择测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株，菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002商业性微生物培养基质量检验规程。3.2 定量测试方法改良Miles-Misra法测试菌株过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度

12、开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37培养18小时；对易计数的区域计数，按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1。3.3 半定量测试方法 改进的划线法接种法平板分ABCD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生

13、长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制，目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受。3.4 定性测试方法平板接种观察法用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养，目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长。三、无菌操作 使用超净工作台的注意事项 （1）使用前30分钟开启紫外灭菌灯，对工作区域进行照射杀菌 （2）使用前20分钟将通风机开启 （3）使用时关闭紫外灭菌灯，开启日光灯 （4）使用完毕，应擦净工作台面，开启紫外灭菌灯消毒灭菌，20分钟后关闭紫外灯，关闭超净台电源 （5）操作区不允许放置不必要

14、的物品，保持洁净、气流畅通 （6）挡风玻璃上下移动时不要用力过猛，以防玻璃破损伤人 （7）长期不使用的工作台要拔下电源插头 （8）请勿在周围有人时开启紫外灯无菌操作人员的工作要求 1、进入检验室必须穿好工作服，戴上工作帽，必要时可戴口罩及手套。工作完毕后离开检验室，脱去工作服，要放在指定地点，工作服要经常洗涤和消毒。2、检验室要经常保持清洁、整齐，禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔或标签等物。3、在检验室进行工作时，严禁喧哗、打闹，保持肃静，不得到处走动，以免影响他人工作。4、在检验中应确保无菌操作，以达到结果正确。未经许可不准将细菌及病料携带出室外，一定要妥善保管和处理好细菌和病料。5、各项仪器要

15、精心爱护，贵重仪器要专人负责，定期检查与保养，使用时按照规定方法使用。6、检验室内各种培养基、试剂、染液等，必须贴上标签，写明名称、规格、配置时间等。不需要的培养物，应立即进行高压蒸汽灭菌处理。 7、经常注意节约水、电、染色液及药品等，在离开检验室时，必须做好防护检查工作，特别是水、电、煤气的检查。8、工作完毕，检验台应及时清理，桌面用消毒液擦拭干净；用过的培养物、病料、动物及器具均须放在指定地点，不得随意乱放或用水冲洗，待灭菌后处理。9、离开检验室时，将用过的物品整理就绪，脱去工作服，将双手用消毒液浸泡35分钟，用肥皂水洗涤干净，方可离开检验室。意外事件的预防（一）工作人员：1、进检验室要穿

16、好工作服，出检验室必须脱下，挂置在指定地点。实行动物解剖及处理新鲜有传染病的组织材料时，应穿好橡皮围裙，戴好橡皮手套。2、研磨干燥细菌或接种细菌是应戴好口罩及眼镜。必须在无菌室或接种橱中进行。工作前后要用紫外线灯消毒。3、吸取强酸、强碱或活菌液时，需用滴管或带胶乳头的刻度吸管吸取，不准用口直接抽吸；死菌液或其他溶液如必须吸取时，可将吸管的吸口上塞上棉花，方可用口吸取。4、检验人员要根据检验室工作性质的不同，定期做预防接种，以增强免疫力。（二）重要设备和珍贵仪器： 恒温箱、冰箱、干燥箱、高压蒸汽灭菌器等应经常保护。使用前要熟悉使用方法及注意事项，并经常检查，如有损坏，立即修理，以免发生危险。 意

17、外事件的处理1、火险：如发现火险时，应关闭电门、煤气门，使用灭火器、沙土、湿布灭火。如系酒精、乙醚、汽油等易燃品引起火险时，切勿用水灭火，衣服着火可就地或靠墙滚转。2、火伤：一般小面积的烧伤涂以5%鞣酸、2%苦味酸、凡士林油等，烧伤严重则到医院处理。3、破伤：先洗净血污，用生理盐水洗涤后涂以2%红汞或2%碘酒。4、灼伤：强酸或强碱灼伤，应先用大量清水冲洗，如为酸灼伤，再用5%碳酸氢钠或5%氢氧化铵洗涤中和；若为强碱则再用5%醋酸或5%硼酸液洗涤中和。如是眼部受伤经上述处理后再滴入橄榄油或液体石蜡12滴。5、吸入酸碱或腐蚀性物质：（1）吸入酸时，立即以大量清水漱口，并服石灰水或牛奶等，勿服催吐药

18、。（2）吸入碱时，立即以大量清水漱口，并服食醋、5%醋酸或服植物油类等以皂化之。（3）吸入石炭酸或来苏儿时，以3040%酒精漱口，并喝适量烧酒或50%酒精，再用催吐剂使吐出。6、吸入菌液时，立即以大量热水漱口，再以消毒液0.1%高锰酸钾、3%过氧化氢漱口，根据不同菌种服用相应的抗生素以预防传染 无菌操作的常用设备 超净台、接种针（环）、酒精灯、镊子、剪刀、药匙、消毒棉球、硅胶（棉）塞、微量移液管、吸管、吸球、试管、平皿、广口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒无菌操作的过程详见实验过程常用消毒剂的配制方法 液体消毒剂的配制：公式：高浓度高浓度体积 = 低浓度低浓度体积固体消毒液的配制：配成n%的某消毒剂，称n克固体消毒剂溶入100mL水中。1、75%酒精：取95%酒精75毫升，置于100毫升量筒中，以蒸馏水稀释至95毫升即可。2、消毒用碘酒溶液：碘3.5克，碘化钾 2.5克，蒸馏水27毫升，95酒精73毫升 配法：将碘化钾溶解于2毫升蒸馏水内，再加入碘，摇匀，使碘溶解于浓碘化钾溶液内。再将酒精加入，如有少许之碘未溶解，可继续溶解于酒精内，待全部溶解后，再加入蒸馏水即成。3、3%双氧水溶液：30%双氧水溶液100ml加水至1000ml4、5%甲酚皂溶液：50%甲酚皂溶液100ml加水至1000ml常用灭菌方法（