细胞工程简介

1、细胞工程细胞工程生物医学系 王兰2014年2月授课内容第一章 细胞工程简介 第二章 细胞工程基础第三章 植物组织与器官培养 第四章人工种子与植物脱毒第五章 植物细胞培养与次级代谢产物制备第六章 原生质体培养与诱变第七章 细胞融合与体细胞杂交第八章 多倍体与单倍体植物第九章 植物离体受精第十章 转基因植物第十一章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白第十二章 杂交瘤技术与单克隆抗体第十三章 体外受精与核移植动物第十四章 多倍体与转基因动物第一章 细胞工程简介第一节第一节 生物工程生物工程 生物工程（生物工程（生物技术）是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能， 设计构建具有预

2、期性状的新物种或新品系（包括细胞系） ，以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。生物技术的内涵主要是： 运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程以及生化工程。 现代生物技术特征现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。基因工程 即重组DNA技术，指根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合，再转入生物体内产生出人们所期

3、望的产物，或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。DNA双螺旋模型双螺旋模型 The DNA Helix Model Watson and Crick ，the brash duo were impatient with authority, dismissive of prevailing opinions - and very eager to win the race to unravel the code. Their 900-word paper, published in Nature (171： 737, 1953), concluded, famously, It has

4、not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.重组重组DNA技术技术 Recombinant DNA Technology 1972 P. Berg creates first recombinant DNA molecules in Results of his experiments, represented crucial steps in the s

5、ubsequent development of recombinant genetic engineering. In 1973 H. Boyer and S. N. Cohen reported the construction of functional organisms that combined and replicated genetic information from different species. Their experiments dramatically demonstrated the potential impact of DNA recombinant en

6、gineering on medicine and pharmacology, industry and agriculture. 细胞工程 细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理，采用细胞培养技术，在细胞水平进行的遗传操作。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。1、细胞培养技术2、细胞核移植技术3、细胞融合技术 克隆羊克隆羊“多莉多莉”的诞生的诞生I. Wilmut, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature 385, 810 - 813, February 27,

7、 1997蝴蝶兰试管苗工厂化生产蝴蝶兰试管苗工厂化生产单克隆抗体单克隆抗体 Monoclonal Antibody G.J.F. Kohler and C.Milstein wined The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies. 酶工程 利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需要的产品或是达到某一特殊目的的一种生物技术。 应用： 天然酶的分离纯化及鉴定和生产 酶的固化技术 酶生

8、物反应器的研制和应用发酵工程 指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术。微生物培养与发酵微生物培养与发酵 Microbial Cell Culture and Fermentation蛋白蛋白质质工程工程 利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造， 并分离、纯化蛋白质， 从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质。生物化学工程 主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产过程中的带有共性的工程技术问题。第二节 细胞工程一、概念一、概念 细胞工程细胞工程（cell engineering ）是应用细胞生物学和分子生物学

9、方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。 广义的细胞工程广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。 动物细胞工程包括：动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。 植物细胞工程包括：植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生

10、质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。二、主要研究内容二、主要研究内容（一）动植物细胞与组织培养 细胞培养、组织培养、器官培养 应用1：用生物反应器大量培养人参等高价值生物的细胞，生产有效药用成分。 应用2：制取许多有应用价值的细胞产品，如单克隆抗体、疫苗、生长因子等。1.动物组织细胞培养技术的建立 1907 年，美国胚胎学家R. Harrison 将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维) 细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于

11、凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至今。 Carrel (1911) 发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34 年，先后继代3400 次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。 1914 年，Thomson 创立了另一条完全不同的体外组织培养途径器官培养法，以后又被Strangeways 和Fell 所发展。 1940 年，Earle 建立了可以无限传代的一个C3H 小鼠的结缔组织细胞系L 系。 1951 年，Gay 建立了第一个人体细胞系人体宫颈癌Hela 细胞系。2.植物细胞

12、培养技术的建立植物细胞培养技术的建立 作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式， 二是激素调控模式。 在植物育种上的应用将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基因；突变体筛选；种质资源保存；种苗脱病毒与快速繁殖等。 （二）细胞融合 19 世纪30 年代，Muller, Schwann, Virchow 等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组

13、织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们的关注，认为这只是一种特殊现象。 1849 年Lobing 在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855 年1858 年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。 1859 年，A. Barli 在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958 年, Okada 发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台病毒能稳定地诱发

14、细胞融合而引起了许多科学家的兴趣，60 年代，Harris(1965) 诱导不同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型， 利用HAT 选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中。 1975 年，免疫学家Kohler 和Milstein 利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，

15、并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段，促进了动物细胞工程的蓬勃发展。（三）染色体工程 按人们的需要来添加、削减、替换染色体的一种技术。 动物染色体工程：对细胞进行微操作。 植物染色体工程：杂交、回交以改变染色体。 单倍体、多倍体育种：四倍体小麦、八倍体黑小麦（四）胚胎工程 对哺乳动物的胚胎进行人为的工程技术操作获得人们所需要的成体动物。 技术包括：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外受精技术、胚胎培养、胚胎移植以及性别鉴定技术、 胚胎冷冻技术等。（五）细胞遗传工程1.动物克隆技术的建立 1891，Heap

16、e 等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4 只安哥拉家兔。 本世纪30 年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道是在1962 年，英国学者Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1的重组卵发育成为成熟蛙。 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于： 实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具

17、有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA 与有关的蛋白质。 1997 年2 月，英国科学家Wilmut 等在世界权威杂志Nature上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。它的贡献在于： 实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。克隆羊克隆羊“多莉多莉”的诞生的诞生I. Wilmut, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mamma

18、lian cells.Nature 385, 810 - 813, February 27, 19972.转基因技术 将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能稳定的遗传给后代的实验技术。三、 细胞工程主要应用（一）优质植物快速培育与繁殖（一）优质植物快速培育与繁殖 基 于植物细胞的全能性，在适当的生长条件下（一定的光照、温度、PH值等）使细胞、组织生长和不断增殖，达到人工优良育种和大量制备次生代谢产物的目的。 如：通过植物胚胎（成熟胚或未成熟胚）和器官（根尖、茎尖、叶原基、花药等）的离体培养，再生成新植株（试管苗）。蝴蝶兰试管苗工厂化生产蝴蝶兰试管苗工厂化生产（二）动物胚胎工程快速

19、繁殖优良、濒危品（二）动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种种 以借腹怀胎的方法提高种畜的利用率。 人工受精、胚胎移植突破了动物交配的季节限制。 利用胚胎分割、核移植、细胞融合、显微操作等可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪。 试管婴儿为人类部分不育患者带来了福音。 还可应用于挽救大熊猫、东北虎等濒危动物。（三）利用动植物细胞培养生产活性产物、药（三）利用动植物细胞培养生产活性产物、药品品 疫苗、菌苗、抗生素、抗体等。 患者活细胞回植治疗癌症、白血病、糖尿病病等。（四）新型动植物品种的培育（四）新型动植物品种的培育 杂种鱼、转基因大豆、小麦等。（五）供医学器官修复或移植的组织工程（五）供医学器官修复或移植的组织工程 利用患者残余器官的少量正常细胞培育完整器官，以供移植。（六）转基因动植物的生物反应器工程