禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定(以发表)

1、 禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定* *（*动物疫病预防控制中心 *）禽巴氏杆菌病又叫禽霍乱和禽出血性败血症，是禽类的一种常见接触性败血性传染病，各种类型的禽均可感染并导致死亡。其特征表现为急性败血过程，发病率和死亡率都很高。低毒感染或急性发病之后，可出现慢性的、局部性的疾病。（一）、病原1、形态染色禽巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的，多杀性巴氏杆菌为卵圆形的短小杆菌，少数近于球形，长约0.62.5 um（微米），宽约0.20.4 um，无鞭毛，不能运动，不形成芽胞。革兰氏染色阴性，多呈单个或成对存在。在组织，血液和新分离培养物中的菌体用美蓝、瑞氏、姬姆萨氏法染色均可着色，菌体呈明显的俩极着色，

2、中间部分着色较浅，很像许多并列的两个球菌，所以又叫两极杆菌。血清型菌株有荚膜，用印度墨汁等染料染色时，可以见到清晰的荚膜。人工培养后及弱毒株，荚膜不明显或消失。2、培养特征巴氏杆菌为需氧兼性厌氧菌。在普通培养基上可生长，37培养1824h（小时），可见灰白色，半透明，光滑，湿润，隆起，边缘整齐的露滴状小菌落，直径约12 mm（毫米）。本菌在鲜血琼脂，血清琼脂或马丁琼脂平皿上培养，生长良好，不溶血。在肉汤中培养时，初期呈均匀混浊，24h后上清清亮，管底有灰白色絮状沉淀，轻摇时呈絮状上升。新分离的细菌接种到马丁琼脂平皿上，通过45°折光观察，可见菌落有荧光，呈橘红色带金光，边缘有乳白色光

3、带，结构细致，边缘整齐，称为Fo型菌落，对鸡等禽致病力强；另一类菌落呈蓝绿色而带金光，边缘有红黄色光带，称为Fg型菌落，对鸡等禽致病力较弱。该菌可利用果糖，甘露糖，蔗糖，产酸不产气；不能利用肌醇乳糖，靛基质，过氧化氢酶，氧化酶和硝酸盐还原阳性，尿素酶阴性，不液化明胶，在麦康凯培养基上不生长，普通琼脂上发育不良或不发育。3、种类多杀性巴氏杆菌的抗原结构比较复杂，分类方法有很多种，Garter在1955年用间接血凝试验根据细菌荚膜将其分为A、B、D、E四个型。Rimler于1987年又发现一种新的荚膜血清型F，17Namioka用盐酸除去荚膜做交叉凝集试验，将该菌分为112个菌体血清型。至此，本菌

4、的血清型可以用荚膜血清型和菌体血清型合并表示，以阿拉伯数字表示菌体抗原，大写英文字母表示荚膜抗原，如5：A。禽巴氏杆菌多属A型，少数见于D型。经我国学者对禽巴氏杆菌分型研究表明，我国流行的禽源巴氏杆菌大部分均为5：A、8：A及9：A。多杀性巴氏杆菌的荚膜与其毒力有关，有致病力的菌株如果失去产生荚膜的能力，可导致其毒力的丢失。已有研究表明多杀性巴氏杆菌在体内繁殖可以产生毒素，内毒素是其主要的毒力因子，引发病理过程。（二）、禽巴氏杆菌的分离与鉴定（1）、病料采集：无菌操作采取死亡鸡肝脏、脾脏、心脏,采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心脏内取样。（2）、涂片

5、镜检：将肝触片和心血涂片，滴加几滴甲醇，作用23 min,自然干燥，然后分别进行革兰氏染色和美兰染色，镜检。（3）、禽巴氏杆菌分离与纯化：无菌取急性死亡的鸡的心血、肝分别接种血液琼脂平板、麦康凯培养基等培养基上，37培养24。观察培养基变化情况并涂片镜检。然后再从血平板上挑单个菌落接种到营养肉汤、厌气肉肝汤观察其生长特性。最后从血平板上挑取疑为禽巴氏杆菌的单个菌落，在含4%血清和0.1%裂解全血的马丁平板上划线，37培养18h备用。（4）、禽巴氏杆菌的纯度检验：将菌株画线接种于鲜血琼脂培养基，37培养1824 h后观察。菌落形态一致的菌落,经涂片，革兰氏染色，镜检。（5）、禽巴氏杆菌的生化试验

6、：将分离的细菌接种到血液琼脂平板上，37培养1824，挑取单取个菌落到乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、尿素酶、葡萄糖、麦芽糖的微量生化反应管中，37培养24后，观察结果。注：附禽巴氏杆菌的生化试验鉴定标准表。表二：巴氏杆菌的生化试验鉴定标准表19试剂乳糖半乳糖蔗糖水样苷果糖甘油山梨醇甘露醇尿素酶菊糖葡萄糖麦芽糖鼠李糖明胶反应-U+-+U+U+-+-U-“+”表示反应，“-”表示无反应，“U”表示通常，“V”表示不定。（6）、禽巴氏杆菌致病试验：将分离的细菌接种营养肉汤，37培养1824后，取5只小白鼠腹腔注射，每只0.1ml，另外取5只按同剂量腹腔注射生理盐水做对照。观察，有死亡小鼠则解剖取心血涂片

7、镜检。（三）、结果（1）、涂片镜检：可见菌体两极浓染，中间部分着色较浅，革兰氏染色为革兰氏阴性小杆菌。（2）、禽巴氏杆菌分离：血液琼脂平板上生长出稍突、白色、半透明、奶油状、不溶血的菌落，营养肉汤和厌气肉肝汤混浊，麦康凯培养基上不生长。镜检为革兰氏阴性、两极着色的短小杆菌，多数单个存在。在含0.1%裂解全血和4%血清马丁琼脂平板上生长的菌落，对光肉眼观察菌落呈微兰色。在低倍显微镜下，以45折光检查，菌落为桔红色荧光。在普通肉汤中能生长。在含4%血清的马丁肉汤中生长良好，呈均匀混浊，少数菌株在管底有微量沉淀。（3）、禽巴氏杆菌的纯度检验：划线平板上菌落生长分布均匀,有一定数量单个菌落,且菌落形态一致。染色镜检见革兰氏阴性小杆菌或球杆菌。（4）、禽巴氏杆菌生化实验：禽巴氏杆菌生化实验的结果如表三所示。根据表二判断，结果符合巴氏杆菌生化特性。表三：禽巴氏杆菌生化实验试剂乳糖蔗糖果糖山梨醇尿素酶葡萄糖麦芽糖结果-+-+-（5）、禽巴氏杆菌致病性实验：注射细菌的小鼠24小时内全部死亡。对照组小鼠无不良反应。死亡小鼠涂片镜检见两极浓染，中间部分着色较浅的小杆菌。（四）、分析根据分离菌涂片镜检的结果、血平板上形成的菌落形态、培养特性、麦康凯培养基上不生长、生化试验结果、动物攻毒试验,可以确诊该分离菌为鸡多杀性巴氏杆菌。（五）、小结细菌的分