02第二章细胞生物学研究方法

1、第二章第二章 细胞生物学细胞生物学的研究方法的研究方法第一节第一节 显微镜技术显微镜技术一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(二二)荧光显微镜荧光显微镜:荧光：特定物质可以在紫外线激发后，发射荧光：特定物质可以在紫外线激发后，发射出更长波长的可见光，即荧光。出更长波长的可见光，即荧光。暗背景，强反差，彩色图像暗背景，强反差，彩色图像（荧光染料）（荧光染料）荧光分子：在激发后可发射荧光的物质即荧光分子荧光分子：在激发后可发射荧光的物质即荧光分子 。 （由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此可做荧光染料用（由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此可

2、做荧光染料用,荧光分子也可以称作荧光染料。）荧光分子也可以称作荧光染料。）荧光显微镜的应用荧光显微镜的应用 定性、定位和定量定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记的研究组织内的荧光标记物质。物质。 对对活细胞活细胞内分子的内分子的动态动态变化进行实时观察。变化进行实时观察。 活细胞的微细结构和变化、分裂和运动等。活细胞的微细结构和变化、分裂和运动等。相差显微镜观察培养中的相差显微镜观察培养中的hela细胞细胞(四四)暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜通过散射光成像应用：应用：分辨率不高。分辨率不高。用于观察未经染色、无色透用于观察未经染色、无色透明的物体的轮廓和运动以及明的物体的轮廓和运动

3、以及活细胞的质膜、纤毛、细胞活细胞的质膜、纤毛、细胞核等结构。核等结构。原理：散射光成像。原理：散射光成像。( (五五) )显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程 原理：原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔时间间隔拍摄。拍摄。应用：应用：准确记录细胞或细胞器的准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度运动过程和速度。 （六）共聚焦激光扫描显微境（六）共聚焦激光扫描显微境 laser confocal scanning microscope, lcsm特点：特点：p高清晰高清晰p可形成被检物体的三维图像可形成被检物

4、体的三维图像结构：结构：普通荧光显微镜（普通荧光显微镜（a）与激光共聚焦显微镜（）与激光共聚焦显微镜（b）的成像比较）的成像比较 二、电子显微技术二、电子显微技术 以以电子束电子束作为光源，作为光源， 波长短，分辨率高波长短，分辨率高电子显微镜分辨率电子显微镜分辨率 理论值：理论值：0.002nm 实际值：实际值：0.1nm 电镜下观察到的结构称为电镜下观察到的结构称为超微结构超微结构或或亚显微结构亚显微结构 (一一)透射电子显微镜（透射电子显微镜（transmission electron microscope，tem ）光学显微镜与透射电子显微镜的比较光学显微镜与透射电子显微镜的比较原理：

5、原理：通过电子束穿透标本后成像。通过电子束穿透标本后成像。 应用：应用：用来观察细胞的超微结构。用来观察细胞的超微结构。透射电镜及其图像透射电镜及其图像扫描电镜及其图像扫描电镜及其图像电镜与光镜区别主要在于：电镜与光镜区别主要在于： （1 1）光源不同）光源不同 光镜为可见光或紫外线光镜为可见光或紫外线, ,电镜为电子束电镜为电子束 （2 2）透镜不同）透镜不同 光镜为玻璃；电镜为电磁透镜光镜为玻璃；电镜为电磁透镜 （3 3）电镜要求真空）电镜要求真空 （4 4）电镜分辨力高）电镜分辨力高( (具体）具体） (5) (5) 成像原理不同（具体）成像原理不同（具体） 第二节第二节 细胞的分离与培

6、养细胞的分离与培养细胞分离的第一步是要将细胞从组织中分离出来，细胞分离的第一步是要将细胞从组织中分离出来，制备出单细胞悬液。制备出单细胞悬液。细胞分离操作的原则：细胞分离操作的原则：p 等渗等渗p 低温低温p 无菌操作无菌操作 根据不同细胞的特征采用不同的细胞分离方法。根据不同细胞的特征采用不同的细胞分离方法。 细胞分离方法细胞分离方法离心方法离心方法 流式细胞术流式细胞术 免疫磁珠法免疫磁珠法 激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术 ( (一一) )离心方法离心方法 利用细胞的利用细胞的密度特性密度特性可有效分离不同的细胞。可有效分离不同的细胞。如血浆白细胞和红细胞的分离。如血浆白细胞和红

7、细胞的分离。 二、细胞培养二、细胞培养细胞培养细胞培养(cell culture)：从机体中取出组织或细胞，从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖的一种方法。殖的一种方法。1.条件条件 营养条件：营养条件：培养基：培养基：rpmi-1640、dmem。 血清。血清。 5%co2 无菌环境无菌环境 2.细胞培养的主要方式是原代培养和传代培养细胞培养的主要方式是原代培养和传代培养原代培养（原代培养（primary culture）：）：直接从体内获取直接从体内获取的组织和细胞进行的首次培养。的组织和细胞进行的首次培养。

8、传代培养（传代培养（secondary culture）：）：原代培养的细原代培养的细胞经过增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一胞经过增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。扩大培养。3.来源于体内的细胞可在体外建系（细胞系）来源于体内的细胞可在体外建系（细胞系）细胞系（细胞系（cell line）：）：在培养的细胞中产生在培养的细胞中产生“不死不死”的的 变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。细胞系的来源细胞系的来源p取材于肿瘤组织的原代培养细胞（取材于肿瘤组织的原

9、代培养细胞（hela细胞系）细胞系）p培养过程中发生转化的正常细胞培养过程中发生转化的正常细胞细胞株（细胞株（cell strain）：）：用细胞克隆化的方法进一步改用细胞克隆化的方法进一步改 善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖 形成的细胞群。形成的细胞群。 单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人kohler和milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。第三节第三节 细胞组分的分离细胞组分的分离 一、细

10、胞裂解一、细胞裂解在细胞组分分离前，首先破碎细胞，制备细胞裂解液在细胞组分分离前，首先破碎细胞，制备细胞裂解液方法：方法：p 低渗透压；低渗透压； p 超声振荡；超声振荡； p 强制通过微孔；强制通过微孔；p 机械破碎及研磨；机械破碎及研磨；p 反复冻融反复冻融 二、细胞二、细胞器及细胞器及细胞组分的分级离心组分的分级离心 (一一)差速离心差速离心（differential centrifugation）方法：方法：从低速到高速逐级沉降。从低速到高速逐级沉降。分离对象：分离对象：体积、质量差别较大的颗粒体积、质量差别较大的颗粒 。细胞骨架细胞骨架细胞骨架细胞骨架匀浆匀浆离心离心1 000g 20分钟分钟细胞核细胞核线粒体等线粒体等离心离心15 000g 120分钟分钟微粒体微粒体离心离心0.26%脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠15 000g 20分钟分钟核糖体等核糖体