s-腺苷异亮氨酸的研究进展

1、第一章 引言 1 SAM介绍和研究进展 S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine），又名 S-腺苷蛋氨酸，是一种广泛存在于生物体内的重要代谢中间物质1-3，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了多种生化反应1, 4, 5，其常用缩写形式有 SAM, SAMe 等。SAM 首先由 Cantoni1, 2发现,其分子式为 C15H22N6O5S，分子量为 398.442，分子结构如图 1.1 所示6。 图1.1 SAM分子结构图 1.1 SAM的生物学功用 SAM 的生物学功用主要体现在转甲基、转硫以及转氨丙基三个方面（图1.2）7-10。 图1.2 SAM 在体内的代谢示意图

2、 2 1.1.1 转甲基作用 SAM 是体内重要的甲基供体，参与体内许多物质的合成与代谢9。在甲基转移酶（MTase）催化下，SAM 提供甲基后生成 SHA（腺苷高半胱氨酸）9, 11。而生成的 SHA 是转甲基反应的竞争性抑制剂，在 SHA 含量上升以及 SAM 含量降低或SAM 与 SHA 比值降低的情况下都将抑制转甲基反应12, 13。许多含 N 物质如：肌酸、松果素、胆碱、肾上腺素、甲氧肾上腺素、鹅肌肽、肉碱、肌碱、甲基组胺、白质、磷脂、多糖、多胺等的甲基化修饰6。比如说，SAM 参与 RNA 中核糖羟基和碱基上的氨基的甲基化，而 DNA 的甲基化修饰也越来越受到关注。在对蛋白质甲基化

3、修饰时，SAM 专门作用于肽链游离氨基上，而对小肽或氨基酸则无作用14。SAM 参与的甲基化反应为细胞膜提供磷脂，调节或维持某些酶活性，维持高激素以及神经递质（如多巴胺，褪黑素，血清素）的水平等15。 1.1.2 转硫作用 SAM 在脱甲基后生成的腺苷高半胱氨酸经随后的代谢生成半胱氨酸，半胱氨酸又可代谢转变为 GSH（谷胱甘肽）16。GSH 是体内硫储存库和细胞主要的抗氧化物质，在慢性肝病患者中，GSH 水平降低的部分原因就是 SAM 合成减少所致17, 18。 1.1.3 转氨丙基作用 SAM 经脱羧后生成的 5'-腺苷甲基硫丙胺转氨丙基给腐胺或亚精胺则生成相应的亚精胺和精胺，这些都

4、是真核生物中重要的多胺，而 5'-甲基硫腺苷是副产物12。在正常的条件下，此代谢途径在体内代谢中所占份额不超过 5%，而在肝移植和早肝癌患者中，则发现此代谢途径会被诱导加强15, 19, 20。 1.2 SAM在临床上的应用21 1.2.1 治疗肝胆疾病22-25 肝细胞液及微粒体中具有多种转甲基酶，含有羟基、巯基或氨基的化合物都需要进行甲基化反应，甲基供体为 SAM。临床上 SAM 能够维持肝脏的正常功能，治疗许多慢性的肝病（包括酒精或非酒精引起的肝硬化，雌激素引起的或其它形式的胆汁郁积），能够逆转许多药物或化合物（如酒精、扑热息痛、类固醇、金属铅等）引起的肝中毒，同时，对多种肝炎和

5、肝功能衰竭具有明显的治疗效果13。 3 1.2.2 治疗精神抑郁症26 可以提高脑内 5-羟色胺和 5-羟吲哚乙酸的水平， 对各种抑郁症27， 尤其是产后抑郁症有效4。而且较之其它同类药物有见效快、无成瘾性、几无不良反应以及耐受性好等优点， 通常在 SAM 周内症状就会明显改善。SAM 与常规抗抑郁药， 如米安色林、氯米帕明、丙米嗪等联合应用比单独用药起效快。 1.2.3 治疗关节炎28 SAM 还有抗炎、缓解疼痛和帮助组织再生的功能， 可促进软骨组织的形成和损伤愈合，维护骨骼关节的健康，对各种关节炎和关节损伤疗效显著。它对骨关节炎的疗效与布洛芬和萘普生相当， 但副作用少、见效快。SAM与非类

6、固醇类抗炎药相比，既不抑制前列腺素合成，也不会影响胃肠道。 1.2.4 治疗纤维性肌痛29, 30 原发性纤维性肌痛是一种慢性非关节性风湿病，症状为全身多处疼痛、僵直，通常还伴有抑郁症等。使用 SAM 后，患者疼痛位点数量减少，不良情绪、身体僵直等症状得到改善。 此外，SAM 还具有降血脂、预防老年痴呆、抗衰老等作用31。 1.3 SAM的获取方法 在生物体内，SAM 的生物合成是由 SAM 合成酶（S-adenosylmethionine synthetase）催化甲硫氨酸（Met）和 ATP 反应完成，即来自于 ATP 的腺苷部分攻击 Met 的硫原子，生成高能量、活泼的有机锍化合物（如图

7、 1.3）。 图1.3 SAM 的生物合成32 在工业生产中，生产 SAM 的方法主要有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法等 3 种。 4 1.3.1 化学合成法 化学合成 SAM 最常用的方法是用甲基供体碘甲烷(CH3I)甲基化 S-腺苷高半胱氨酸，但由于其产率低，反应产物又为(±)SAM 的混合物，且难以分离得到有活性的(-)构型产物等明显缺点，故而很少被实际应用27。 1.3.2 酶促转化法 酶促转化法主要利用 SAM 合成酶，催化底物 L-甲硫氨酸和 ATP 生成(-)SAM，且 SAM 合成酶有三磷酸酶活性，使三磷酸分解为焦磷酸和磷酸。 Cantoni GL1首先用从大鼠

8、肝脏细胞中提取的 SAM 合成酶催化合成 SAM,催化底物 L-甲硫氨酸和 ATP 合成出 SAM。随后又有人从大肠杆菌和酵母中分离 SAM 合成酶。Cross A25等从组织和 S.cerevisiae 中分离 SAM 合成酶合成具有生物活性的 SAM；Marthews RG33等利用基因工程手段，将 SAM 合成酶克隆到 E.coli (metK)中表达，并利用从该工程菌中提取的酶合成 SAM。该法具有反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短以及无污染等优点，但是，SAM 合成酶在动植物和微生物体内含量少，酶活力不高，成本太高，且分离纯化困难，所以一般只用于合成同位素标记的 SAM34。

9、1.3.3 微生物发酵法 某些微生物可以在细胞内积累 SAM，通过对这些微生物的发酵，尤其是在培养基中添加一定量的L-甲硫氨酸的情况下，可以获得大量的 SAM。因此通过微生物的发酵，再从中提取精制 SAM 是目前工业生产 SAM 的主要途径。 Schlenk BF35从富含 L-Met 的面包酵母提取 SAM，但产物含量低，分离纯化困难，没法形成可行的生产工艺；Shiozaki36通过筛选 300 多株不同的菌株，分离到一株 Saccharomyces sake K-6 菌，该菌在 10L 发酵罐中培养 7 天后的SAM 产量高达 10.8 g/L(菌体生物量达到 53 g/L)36, 37。

10、这是目前从各种专利和刊上所查到的最高产量。 2 SAM合成酶介绍和研究进展 2.1 各种生物体内的SAM合成酶介绍 SAM 合成酶广泛存在于动、植物和微生物体内。生物工程法常用的SAM 合成酶主要有大肠杆菌SAM合成酶，酵母SAM 合成酶和大鼠 SAM合成酶。 5 大肠杆菌的 SAM 合成酶由 Markham 等38报道发现。它的基因位于大肠杆菌染色体图的65 分处，由 1152bp 组成，编码分子量为 41,941 Dalton的亚基。 大鼠 SAM 合成酶存在于大鼠肝脏、肾脏、脑组织。Cabrero 等39发现大鼠肝脏内有高分子量和低分子量 2 种 SAM 合成酶。高分子量 SAM 合成酶

11、分子量为 210,000 Dalton，是四聚体；低分子量SAM 合成酶分子量为110,000 Dalton，是二聚体。Saburo 等40从gt1 1 文库中分离得到编码大鼠肝脏 SAM合成酶的cDNA 克隆，编码含 397 氨基酸残基的亚基蛋白，分子量为 43,647 Dalton。该 cDNA 克隆与 met K 有 52同源性。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的 SAM 合成酶由 Chiang 等41通过 DEAE纤维素分离发现。酿酒酵母的 SAM 合成酶有两种类型，即 SAM1 和 SAM2，并分别以二聚体和四聚体的形式存在。Cherest等42证明这两

12、种类型的酶分别由 2 个不连锁的基因 SAM1 和 SAM2 所编码。Thomas 等43报道了酿酒酵母 SAM 合成酶基因SAM1 的核苷酸序列。SAM1 的编码序列长 1149bp，编码含 382 氨基酸残基的亚基， 分子量为 41800 Dalton。SAM1 和 metK 的同源性高达 52。Thomas 等44进一步报道了酿酒酵母 SAM 合成酶基因 SAM2 的核苷酸序列。SAM2的编码序列长 1152bp，编码含 384 氨基酸残基的亚基，分子量为 42300 Dalton。SAM1 和 SAM2 的同源性为 83，所编码的多肽氨基酸序列的同源性高达 92%，说明 SAM1 和

13、SAM2 为复制基因。 其他，一些微生物 SAM 合成酶及其编码基因被陆续报道，如 Bacillus subtilis 的 SAM 合成酶由 metE 编码。另外，大豆、小麦等植物的 SAM 合成酶及其编码基因也被发现32。 2.2 各种SAM合成酶的酶活力比较。 Markham 等45用重组大肠杆菌 SAM 合成酶进行的转化实验发现了产物抑制问题。Markham 等认为 SAM 是大肠杆菌 SAM 合成酶抑制剂，可以和SAM 合成酶形成不活泼的酶复合物，它对 ATP 竞争性抑制（Ki=0.01mmol/L），又与 L-甲硫氨酸呈反竞争性抑制（Ki0.01mmol/L）。Pajares 等46

14、构建了表达大鼠肝脏的 SAM 合成酶的重组大肠杆菌，并申请了专利。Matos 等38对不同种类 SAM 合成酶的活力作了比较。 6 表 1.1 不同种类 SAM合成酶活力比较 酶原 Km(L-Met) 比活力（U/mg） 分子量（×103） 酿酒酵母（sam1） 0.367 43 酿酒酵母（sam2） 0.28 1.623 43 大肠杆菌（metK） 0.20 2.2 4×43 大鼠肝脏（高分子量） 0.043 0.01 210 大鼠肝脏（高分子量） 0.13 0.02 110 由表1.1可见， 酵母两种SAM 合成酶的同功酶，即 SAM1 和SAM2，虽然两者的氨基酸同源

15、性高达 92%，但 SAM1 存在产物抑制作用，而 SAM2 却没有。而大肠杆菌合成酶虽然从反应速度和比活力上略好于酵母 SAM 合成酶，但 SAM 是大肠杆菌 SAM 合成酶抑制剂，可以和 SAM 合成酶形成不活泼的酶复合物，它对 ATP 竞争性抑制（Ki=0.01mmol/L），又与 L-甲硫氨酸呈反竞争性抑制（Ki=0.01mmol/L），也存在着产物抑制问题。大鼠肝脏 SAM 合成酶的 L-甲硫氨酸 Km最低，其比活力不高。因此，经过综合分析我们选择将克隆得到的酿酒酵母来源的SAM2 基因整合至毕赤酵母中进行表达。 3 毕赤酵母表达系统 毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种

16、甲醇酵母，它可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。这是因为其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径（图1.4）的必需酶，如醇氧化酶（alcoholoxidase, AOX）、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等。其中醇氧化酶是甲醇利用途径中的第一个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢47。当细胞以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时不能检测到 AOX 的活性，而在甲醇培养的细胞内，该酶可占细胞总蛋白的 30% 以上48。毕赤酵母基因组中具有两个 AOX 基因：aox1和aox2, 其启动子序列常常被用来构建用于毕赤酵母中的表达载体. 7 图1.4 毕赤酵母的甲醇代谢途径49 3.1 毕赤酵母表达系统的优

17、点 作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点： 1) 在甲醇诱导下的高密度大体积连续发酵培养。巴斯德毕赤酵母能在简单的培养基(包括盐、微量元素、生物素和碳源)上良好地生长，在甲醇诱导下进行大体积高密度连续发酵培养，表达水平稳定，能够忍耐较宽的酸碱度变化(pH 值 3.0-7.0)，利于在发酵过程中通过调节pH 值来抑制蛋白水解酶活性，防止发酵过程中产生的蛋白水解酶对表达蛋白的降解例。 2) 培养成本低，产物易分离。毕赤酵母发酵培养的营养要求低，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。 3) 外源基因遗传稳定。由于巴斯德

18、毕赤酵母无内源型载体，一般外源目的基因通过同源重组，可稳定地整合表达载体到宿主染色体中。 8 4) 利于表达产物的纯化。在巴斯德毕赤酵母中表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞外，巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于外源蛋白纯化。 5) 具有强有力的且很易控制的乙醇氧化酶基因(aox)启动子，可严格调控外源蛋白的表达。 6) 高表达量。各种蛋白质在巴斯德毕赤酵母中的产生水平约为细菌、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统产量的l0-l00倍。破伤风毒素在巴斯德毕赤酵母中的产量已达12g/L ，还有许多蛋白可达到每升克以上水平。 7) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰，即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白的磷酸化、折叠、信号序列加工、糖基化等。 8) 胞内表达蛋白的