赤芍化学成分没食子酸丙酯在大鼠体内代谢探究

1、赤芍化学成分没食子酸丙酯在大鼠体内代谢探究摘要为了阐明赤芍化学成分没食子酸丙酯在大鼠体内的代谢情况，归属赤芍代谢产物的原型成分来源，该 研究首次对没食子酸丙酯进行了动物体内代谢研究。灌胃给 予大鼠没食子酸丙酯混悬液，收集尿液和血液，采用液质联 用技术检测、鉴定没食子酸丙酯在大鼠体内的代谢产物。通 过对比没食子酸丙酯和赤芍代谢产物的液质数据，归属赤芍 代谢产物的来源。最终从大鼠含药尿液中鉴定没食子酸丙酯 代谢产物33个，从大鼠含药血浆中鉴定没食子酸丙酯代谢 产物20个，除去相同的代谢产物，共从大鼠的含药尿液和 血浆中鉴定代谢产物37个，其中17个代谢产物和赤芍的代 谢产物相同。它们主要为没食子酸

2、丙酯、没食子酸丙二醇酯、 没食子酸和焦没食子酸的二相结合产物。37个代谢产物中 35个为没食子酸丙酯的新代谢产物，推测22个为新化合物。 本研究明确了赤芍的代谢产物中有17个可以来自于没食子 酸丙酯，为阐明赤芍代谢产物的来源及没食子酸丙酯在体内 的代谢途径奠定基础，并有助于寻找没食子酸丙酯在体内的 显效形式。关键词没食子酸丙酯；代谢产物；代谢途径；液质联用；赤芍；显效形式收稿日期2013-05-28基金项目国家自然科学基金重点项目(30830120)； 中国博士后科学基金项目(20080430293)通信作者蔡少青，tel/fax： (010) 82801693, e-mail: sqcai；

3、 徐风，tel/fax： (010) 82802534, e-mail： xufeng_pharm163 com作者简介梁静，博士，主要从事天然药物的体内代 谢研究，e-mail： 1 jingbjmu. edu. cn没食子酸丙酯，是常用中药赤芍的有效成分之一 1。 笔者前期对赤芍的体内代谢进行了较为系统的研究，从灌胃 赤芍后的大鼠尿液和血浆中共鉴定出15个吸收成分和90个 代谢产物，推测其中31个代谢产物可能来自于赤芍中的没 食子酸类成分2。没食子酸丙酯最早由我国学者对赤芍有 效成分没食子酸进行结构修饰而得到，较没食子酸具有更强 的生物效应3。其具有抗氧化作用4,抗血小板聚集作用 5,对大

4、鼠缺血再灌注时心肌线粒体功能具有保护作用 3,同时有报道称没食子酸丙酯可改善荷瘤鼠血液凝固状 态和血小板功能而实现其抗肿瘤作用6。nakagawa y等认 为肝细胞可将没食子酸丙酯代谢为没食子酸、4-0-甲基-没 食子酸、没食子酸二聚体7。叶藤芝等认为在人工胃、肠 液中没食子酸丙酯稳定，在小鼠肝微粒体液中代谢明显8。 进行没食子酸丙酯的体内代谢研究有助于阐明其代谢产物 和代谢途径，进而揭示它在体内的存在形式，这对于确定没 食子酸丙酯的体内显效形式及药理作用机制，对于预测潜在 的药物相互作用具有重要意义。1材料岛津shimadzu lc-ms-it-tof液质联用仪：由2个 lc-20ad输液泵

5、、1个lc-20ab输液泵、cbm-20a系统控制器、 脱气单元dgu-20a3.可制冷自动进样器sil-20ac.柱温箱 ct0-20a.二极管阵列检测器spd-m20a. esi离子源、离子 阱-飞行时间质谱系统等模块构成。数据的采集和处理采用 shimadzu 公司的 lcmssolution version 3. 60. 361 软件、分 子式和元素组成预测采用formula predictor和accurate mass calculator 软件。乙睛（hplc级，美国fisher公司）；甲酸（hplc级， mreda technology）,甲醇（色谱纯，天津大茂化工厂），去 离

6、子水（18.2mq,经m订li-q纯水净化系统纯化）,cmc-na （分析纯，科贸化学试剂有限公司）。取血管（3.8%枸椽酸 钠1 ： 4,河北鑫乐科技有限公司）。没食子酸丙酯（批号f20090707）和没食子酸甲酯（批 号f20110318）均购自国药集团化学试剂有限公司；没食子 酸（批号20110905）购自上海展舒化学科技有限公司；3-0- 甲基-没食子酸（批号00013562-023）与没食子酸乙酯（批 号wzgyc-0g）均购自百灵威科技有限公司。sd大鼠，雄性，体重250300 g,购于北京大学医学 部动物科学部。所有动物实验均得到北京大学医学部伦理委 员会的许可，许可证号la20

7、11-058o2方法2. 1没食子酸丙酯溶液配制将没食子酸丙酯混悬于 0. 5% cmc-na溶液中，使用前再次涡旋混匀。2.2生物样品的收集与处理 把12只大鼠随机分为空白 组和给药组，每组6只大鼠，分组后即放入代谢笼中进行饲 养，先适应7d。之后灌胃给药3d,每天1次，剂量为500 mg kg-1大鼠体重，空白组给同样体积的0. 5% cmc-na溶液, 给药期间正常给水给食。第1次和第2次给药后收集24 h内的尿液，每天收集 之后置-30 °c冰箱保存，最终将收集到的尿液用旋转蒸发仪 在50 °c浓缩至干，取其中1.00 g加4 ml甲醇超声提取30 min, 5 0

8、00 r min-1 离心 15 min,取上清液，过 0. 45 p m 滤膜，待液质分析。在第3次给药后，分别在给药后0.5, 1, 1.5 h取2只 大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，心脏穿刺取血，将所取全血 于3 000 r min-1离心15 min,取上清液，从中取5 ml, 加20 ml （4倍量）甲醇超声20 min, 5 000 r min-1离心 15 min去除蛋白，取上清液，用旋转蒸发仪在40 °c浓缩至 干，加5ml甲醇过0.45 u m滤膜，用氮气吹干，加200 u l甲醇超声30 min, 5 000 r min-1离心15 min,取上清液 以备液质分析。2

9、.3液质分析条件hplc检测条件：phenomenex gemini c18 色谱柱（4. 60 mmx250 mm, 5 u m）； 柱温35 °c；进样体积5 pl；流动相a-0. 1%甲酸，b-乙睛; 流速1. 00 ml min-1,分流为0. 20 ml min-1后进入质谱; 洗脱梯度 012 min, 0%b； 1233 min, 08%b； 3337. 5 min, 8% b； 37. 552. 5 min, 8%12% b； 52. 582. 5 min, 12%25%； 82. 5105 min, 25%60% b； 105120 min, 60%100%bo质谱

10、检测条件为esi离子源；msims3检测范围（m/z） 为501 000；离子累积时间，2030 ms；雾化气（氮气） 流速，1.5lmin-1；曲型脱溶剂管和加热块温度，200 °c； cid能量50%；检测器电压，1.70kv；干燥气（氮气）压力， 98.0 kpa；检测模式，正、负离子切换检测。3结果3. 1对照品质谱裂解特征为了鉴定没食子酸丙酯的体 内代谢产物，本研究通过质谱技术研究对照品没食子酸丙 酯、没食子酸乙酯、没食子酸甲酯、3-0-甲基-没食子酸、 没食子酸的质谱裂解规律，并比较了同分异构体没食子酸甲 酯和3-0-甲基没食子酸的质谱裂解特征，发现二者的差异在 于：负离

11、子检测模式下特征离子m/z 168. 00和m/z 124. 02 的相对丰度不同，没食子酸甲酯特征离子m/z 124. 02的相 对丰度比m/z 16&00的相对丰度高，而3-0-甲基-没食子酸 特征离子m/z 124. 02的相对丰度比m/z 168. 00的相对丰度 低。3-0-甲基没食子酸的二级质谱中，可以观察到准分子离 子m-h-直接失去c02生成的m/z 139. 04离子，而没食子 酸甲酯的二级质谱中则无该离子出现。据此可以区分二者。3.2对照品紫外（uv）谱特征文献报道没食子酸类化 合物（没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酰基葡萄糖）在 215, 273 nm处显示没食子

12、酸骨架的特征吸收9。没食子酸 的二相代谢产物没食子酸硫酸酯的uv谱未发生明显变化， 但没食子酸脱竣基的代谢产物uv谱的215 nm吸收峰消失， 甲基化代谢产物270 run吸收峰紫移至255 nm10。作者利 用hplc-dad对没食子酸丙酯、没食子酸乙酯、没食子酸甲 酯、3-0-甲基-没食子酸、没食子酸的uv谱进行研究，发现 他们的uv特征同上述文献报道一致，也在215, 273 nm处显示没食子酸骨架的特征吸收。3. 3大鼠含药血浆及尿液中没食子酸丙酯代谢产物的分析鉴定采用液质联用技术，从灌胃没食子酸丙酯的大鼠 尿液中鉴定代谢产物33个，从含药血浆中鉴定代谢产物20 个，除去相同的代谢产物

13、，共鉴定37个没食子酸丙酯代谢 产物（表1）。除没食子酸、4-0-甲基-没食子酸外，其他35 个代谢产物均为没食子酸丙酯的新代谢产物。其中22个化 合物的各种可能的结构在scifinder美国化学文摘数据库中 均未能查到，因此推测这22个化合物为新化合物。这些代 谢产物的主要结构类型有：没食子酸丙酯的硫酸酯化、甲基 化和葡萄糖醛酸化产物，没食子酸丙二醇酯的硫酸酯化产 物，没食子酸的甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化产物，焦 没食子酸的甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化产物，这些代 谢产物的发现有助于揭示没食子酸丙酯在大鼠体内的直接 显效形式。各代谢产物的鉴定过程如下。ml, m2, m5, m6：在负

14、离子模式下，ml, m2, m5, m6的 准分子离子m-h-分别为 m/z 387. 092 6,387. 096 5,291. 016 4, m/z 291.017 2,预测其分子式表1大鼠含药尿液和血 浆中没食子酸丙酯代谢产物的液质数据(负离子模式下)table 1 the lcms data obtained in negative ion detection mode (ni) for metabolites of propyl gallate in urine and plasma of rats注：1)新化合物；2)与赤芍代谢产物相同；+检测到; - 未检测到。分别为 c16h2

15、0011, c16h20011, c10h1208s, c10h1208s。 在二级质谱图中，可见它们分别通过丢失c6h806 (176. 02), c6h806 (176.02), s03 (79. 95), s03 (79. 95)中性片段而 得到的母核离子aglycon-h- ( m/z 211. 06),预测母核的 分子式为c10h1205,据此推测ml和m2为c10h1205的葡萄 糖醛酸结合物，m5和m6为c10h1205的硫酸结合物。母核离 子进一步裂解产生特征碎片离子m/z 169.01, m/z 125. 02, 与没食子酸丙酯的裂解特征一致，据此确定ml和m2为没食 子酸丙

16、酯葡萄糖醛酸昔，m5和m6为没食子酸丙酯硫酸酯。此外，ml与m2为同分异构体，二者质谱裂解规律一致，但 在反相hplc ±的保留时间不同，根据clogp规律2,推测 保留时间相对比较大的ml (tr 85. 87 min)为没食子酸丙酯 -3-0-葡萄糖醛酸昔(clogp-0. 179 579), m2 (tr 69. 592 min) 为没食子酸-4-0-葡萄糖醛酸昔(clogp-0. 499 579)o m5和 m6为同分异构体，二者质谱裂解特征一致，根据clogp规律, 推测保留时间较大的m6 (tr 123.893 min)为没食子酸丙酯 -3-0-硫酸酯(clogp 0.

17、485 721), m5 (tr 104. 357 min) 为没食子酸丙酯-4-0-硫酸酯(clogpo. 415 721)om3和m4：在负离子一级质谱图中，m3和m4在m/z 401. 10处 显示相同的准分子离子m-h-,预测它们的分子式为 c17h22011o在二级质谱图中，可观察到准分子离子能丢失 c6h806 (176. 02)中性片段，推测二者为葡萄糖醛酸结合 物。经与ml, m2母核的质谱裂解特征比较，推测m3和m4 的母核为甲基化没食子酸丙酯。同时根据clogp规律，最终 推测m3 (tr 75. 343 min)为4-0-甲基没食子酸丙酯葡萄糖 醛酸昔(clogp-0.

18、499 579), m4 (tr 80. 833 min)为 3-0- 甲基没食子酸丙酯葡萄糖醛酸昔(clogp-0. 179 579)om8, m9, m10：在负离子一级质谱图中，m8, m9, m10的准分子离子m-h-分别为 m/z 271.003 1, 277. 002 3, m/z 373. 079 4o在二级质谱图中，可观察到准分子离子分别通 过丢失 s03 (79. 95), s03 (79. 95), c6h806(176. 02)中性片段得到相同的母核离子aglycon-h- (m/z 197. 04), 据此预测母核的分子式为c9h1005,推测母核可能为没食子 酸乙酯或

19、二-0-甲基没食子酸。在多级质谱图中，母核离子 进一步裂解产生特征碎片离子m/z 182. 02, 167. 00,与没食 子酸乙酯的质谱裂解特征不一致，从裂解规律可以判断母核 为二-0-甲基没食子酸。根据以上信息，推测m8和m9为二 -0-甲基没食子酸硫酸酯，m10为二-0-甲基没食子酸葡萄糖 醛酸昔。m12, m14, m15, m16：在负离子模式下，m12, m14, m15, m16 的准分子离子m-h-分别为 m/z 262. 986 3, 342. 942 4, m/z 359. 061 3, 359. 061 5o 它们分别通过丢失 s03 (79. 95), 2 个 s03

20、(79.95),c6h806 (176.02)和 c6h806 (176.02)中性片段产生相同的母核离子aglycon-h- (m/z 183. 03), 据此预测母核的分子式为c8h805o母核离子进一步裂解产生 特征碎片离子 m/z 183. 03, 168. 00, 124.02, 139. 04,与甲 基没食子酸质谱裂解特征一致，且m12的uv谱与4-0-甲基 没食子酸的uv谱一致(图1),根据文献报道10,硫酸酯 化对化合物的uv谱没有影响，因此可以判断m12为4-0-甲 基没食子酸硫酸酯。m14为4-0-甲基没食子二酸硫酸酯。根 据文献10和m15, m16的质谱裂解特征，推测m

21、15和m16 为甲基化没食子酸-葡萄糖醛酸昔，根据clogp规律，最终 推测m15 (tr 26. 888 min)为4-0-甲基-没食子酸-葡萄糖 醛酸昔(clogp-1.593 48), m16 (tr 31.975 min)为 3-0- 甲基-没食子酸-葡萄糖醛酸昔(clogp-1.493 48)oa. m12； b. 4-0-甲基没食子酸。图1 m12和4-0-甲基没食子酸的紫外图谱fig. 1 the uv spectra of m12 and 4-0-methylgallic acidm18, m19, m20, m21： m18, m19, m20 的准分子离子m-h- 分别为

22、m/z 345. 045 1, 345. 046 3, 248. 971 2, 248.971 1, 据此预测它们的分子式分别为c13h14011, c13h14011, c7h608s, c7h608so在多级质谱图中，它们显示相同的母核 离子aglycon-h- ( m/z 169. 01),经确认母核为没食子酸, 根据它们的特征中性丢失，可以确定m18和m19为没食子酸 葡萄糖醛酸昔，m20和m21为没食子酸硫酸酯。根据clogp 规律，最终推测在反相hplc上具有较大保留时间(tr 27. 455 min)的m19为没食子酸-3-0-葡萄糖醛酸昔(clogp-1. 728 59), m

23、18 (tr 18. 858 min)为没食子酸酸-4-0-葡萄糖醛酸 昔(clogp-2. 048 59)om23, m24, m25：在负离子模式下，m23, m24, m25的准 分子离子m-h-分别为 m/z307. 010 6, 307. 010 5, 307. 0107, 预测它们的分子式为c10h1209s,经丢失s03 (79. 95)中性片段产生母核离子aglycon-h- ( m/z 227. 056 2),母核 离子进一步丢失c3h6o,产生特征碎片离子m/z 169.01,根 据碎片离子m/z 169.01的元素组成可以确定其为没食子酸, 根据以上信息确定母核离子为没食

24、子酸丙二醇酯，结合特征 中性丢失，最终确定m23, m24, m25为没食子酸丙二醇酯- 硫酸酯。m26和m28：在负离子模式下，m26和m28的准分子离子m-h-分别为m/z 204. 982 3, 301.055 2o在 二级质谱图中，可见它们分别通过丢失s03(79. 95)和c6h806(176. 02)中性片段产生相同的母核离子aglycon-h - (m/z 125. 02),推测母核的分子式为c6h603,判断母核为焦没食 子酸，最终推测m26为焦没食子酸硫酸酯，m28为焦没食子 酸葡萄糖醛酸昔。m37：在负离子一级质谱图中，m37在m/z 315. 073 2处 显示准分子离子

25、m-h-,在二级质谱图中，可看到母核离子 m/z 139. 045 6 (元素组成：c7h803)和葡萄糖醛酸片段的 特征离子m/z 175. 028 2,说明该化合物为葡萄糖醛酸结合 物。母核离子通过丢失ch3游离基产生碎片离子m/z 124. 021 4,根据元素组成，可以判断母核为甲基化焦没食子酸。最 终推测m37为0-甲基焦没食子酸葡萄糖醛酸昔。此外，采用与对照品或者参考文献2中的液质数据进 行对比的方法，对代谢产物m7, mil, m13, m17, m22, m27, m29m36进行了鉴定(表1)。3.4没食子酸丙酯在大鼠体内的代谢产物谱研究采用 液质联用技术，从大鼠含药尿液和血

26、浆中共鉴定出37个没 食子酸丙酯的代谢产物，发现主要的代谢反应类型有：務基 化、脱竣、甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化。根据代谢产 物的结构特点及代谢反应类型，推测没食子酸丙酯在大鼠体 内的代谢途径（图2）。图2没食子酸丙酯在大鼠体内的代谢产物及代谢途径fig.2 the metabolites and proposed metabolic pathways of propyl gallate in rats3. 5 通过对比没食子 酸丙酯和赤芍的代谢产物，归属赤芍代谢产物的来源前期 作者推测赤芍代谢产物中有31个可能来自没食子酸类成分2 。本研究鉴定了 37个没食子酸丙酯的代谢产物，通过对 比

27、hplc保留时间以及多级质谱数据，发现有17个和前期报 道的赤芍代谢产物相同（表1）。这表明，没食子酸丙酯确实 是赤芍的这些代谢产物的原型成分之一。4讨论在本研究中作者采用了 hplc-dad-esi-it-tof-msn技术 从复杂的生物样品中筛选和鉴定没食子酸丙酯的代谢产物， 该技术具有如下优点：首先esi源质谱适合检测中高极性的 化合物（代谢产物的极性通常较大），且它是一种浓度型的 检测器，因而可不受样品量的影响，在药物代谢分析中有很 好的应用；同时it-tof复合型质谱仪灵敏度好、分辨率高, 具有高达十级质谱（ms10）的准确质量测定功能，可以精确 测定各级离子的质量数并推测元素组成，

28、为代谢产物的结构 鉴定提供方便。本研究共鉴定了没食子酸丙酯的代谢产物37个，其中 17个代谢产物和作者前期报道的赤芍的代谢产物相同2。 这表明赤芍的31个可能来自于没食子酸类成分的代谢产物 中，有17个可以来自于没食子酸丙酯，而另外14个代谢产 物则可能来自于没食子酸丙酯之外的其他没食子酸类成分， 如没食子酸、没食子酸乙酯，或者以没食子酸为基本单元的 可水解软质等。因此本研究结果为归属赤芍在大鼠体内代谢 产物的原型成分来源提供了重要依据。药物进入体内后在各种代谢酶的作用下，产生各类结构 形式的代谢产物。代谢产物中有些可能具有活性。它们到达 相应的靶点后，进而发挥药理作用，因此对药物的体内代谢

29、进行研究，有助于揭示药物的体内显效形式，进而揭示其药 效机制。本研究鉴定了没食子酸丙酯的代谢产物37个，其 中新代谢产物35个，新化合物22个。这些代谢产物有可能 对没食子酸丙酯的体内药理作用也有重要贡献，其中m17（没 食子酸）具有多种生物活性报道，可能为其显效形式。本研究从大鼠血浆中检测到了 20个代谢产物，从尿液 中则检测到了 33个代谢产物，说明尿液更有利于代谢产物 的分析鉴定。此外，焦没食子酸类代谢产物主要存在于尿液 中，在含药血浆中几乎不存在，据此，作者推测没食子酸丙 酯的脱竣基反应可能主要发生在没食子酸丙酯及其代谢产 物随血液循环最终进入肾脏之后的环节。本研究为阐明没食 子酸丙酯

30、的体内代谢途径和显效形式奠定了基础，同时对其 安全用药和药理机制研究均具有一定参考价值。参考文献1 阮金兰，赵钟祥，曾庆忠，等赤芍化学成分和药理作用的研究进展j.中国药理学通报，2003,19 (9)：965.2 liang j, xu f, zhang y z, et al. the profilingand identification of the absorbed constituents and metabolites of paeoniae radix rubra decoction in rat plasma and urine by the hplc-dad - esitt -

31、 tof-msn technique :a novel strategy for the systematicscreening and identification of absorbed constituents and metabolites from traditional chinese medicinesj. j pharm biomed anal, 2013, 83： 108.3 曾蝶，李元建.没食子酸丙酯对大鼠缺血再灌注心肌线 粒体损伤的保护j.中国现代医学杂志，2005,15 (14)：2139.4 garrido j, garrido e m, borges f.studi

32、es on the food additive propyl gallate :synthesis ，structural characterization, and evaluation of the antioxidant activityj. j chem educ, 2012,89 (1 )：130.5 金成赞丙酯注射液的安全性实验d.延边：延 边大学，2007.6 胡素坤，李晓琳，王少君，等.赤芍801抗肿瘤作用的实验研究j.中国医药学报，1990,5 (3)：22.7 nakagawa y, nakajima k, tayama s , etal. metabolism and c

33、ytotoxicity of propyl gallate in isolated rat hepatocytes： effects of a thiol reductant and an esterase inhibitor j mol pharmacol, 1995,47(5)：1021.8 叶蕨芝，蔡晶，徐伟，等.没食子酸丙酯在大鼠体内生物利用度的测定j.福建中医学院学报，2008,18(3) ：27.9 王瑞.川赤芍化学成分与芍药质量控制方法研究 d.沈阳：沈阳药科大学，2005.10 yan z, chen y, li t, et al. identificationof metab

34、olites of si-ni-san, a traditional chinese medicine formula, in rat plasma and urine using liquid chromatography/diodearraydetection/triple-quadrupolespectrometryj jchromatogr b： anal technol biomed life sci,2012,73：885.metabolite profiling of propyl gallate in rat plasma and urine byhplc-dad-esi-it

35、-tof-msn techniqueliang jing, xu feng, shang ming-ying, liu guang-xue, wang xuan, cai shao-qing(state key laboratory of natural and biomimetic drugs, school of pharmaceutical sciences,peking university, beijing 100191, china)abstract to make a clear understanding of the in vivo met abolism of propyl

36、 galla te in rats and det ermine the original compounds of the metabolites of paeoniae radix rubra (prr), the urine and plasma of the rats administrated with propyl gallate were collected, and then the hplc-dad-esi-it-tof-msn technique was applied to screen and identify the metabolites of propyl gallate from these bio-samples .by comparing the collected