第五讲DNA的复制-1

1、 分子生物学分子生物学 专业：生物工程专业：生物工程 主讲教师：陈秀丽主讲教师：陈秀丽 （bio_）Molecular Biology CourseMolecular Biology CourseThe replication of DNA Molecular Biology Course第五讲第五讲 DNA的复制的复制 一、一、DNA的复制的复制 二、二、RNA的反转录的反转录 三、三、DNA的转座的转座Molecular Biology Course 脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）是生物界遗传的主要物质基础。是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在生物有机体

2、的遗传特征以密码的形式编码在DNA分子上，分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序即遗传信息。表现为特定的核苷酸排列顺序即遗传信息。在细胞分裂前通过在细胞分裂前通过DNA的复制，将遗传信息由亲代传递的复制，将遗传信息由亲代传递给子代。给子代。在后代的个体发育过程中，遗传信息自在后代的个体发育过程中，遗传信息自DNA转录给转录给RNA，并指导蛋白质的合成，以执行各种生命功能。并指导蛋白质的合成，以执行各种生命功能。使后代表现出与亲代相似的遗传性状，这种遗传信息的传使后代表现出与亲代相似的遗传性状，这种遗传信息的传递方向，是从递方向，是从DNA到到RNA再到蛋白质，即所谓的生物再到蛋白质，即所谓的生物学

3、学“中心法则中心法则”。80年代以后，在某些致癌年代以后，在某些致癌RNA病毒中发现遗传信息也存病毒中发现遗传信息也存在于在于RNA分子中，由分子中，由RNA通过逆转录的方式将遗传信通过逆转录的方式将遗传信息传递给息传递给DNA。这个中心法则加入了新的内容。这也这个中心法则加入了新的内容。这也就是我们前面提到过的，目前被生物界认可的遗传信息就是我们前面提到过的，目前被生物界认可的遗传信息传递的中心法则。传递的中心法则。 Molecular Biology Course 复制复制转录转录反转录反转录翻译翻译DNADNARNARNAPROPRO生理功能生理功能遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中

4、心法则Molecular Biology Course第五讲第五讲 DNADNA的复制的复制（一）、（一）、DNADNA的复制的复制（二）、复制的起始阶段（二）、复制的起始阶段（三）、（三）、DNADNA复制的延长阶段以及参与的复制的延长阶段以及参与的 酶和蛋白质分子酶和蛋白质分子 （四）（四）、DNADNA复制的终止阶段复制的终止阶段（五）、复制的几种主要方式（五）、复制的几种主要方式（六）、真核生物复制六）、真核生物复制Molecular Biology CourseDNADNA复制（复制（the the Replication of DNA）亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNA

5、DNA聚合酶的作用下，分别聚合酶的作用下，分别以每单链以每单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的以互补配对的游离的dNTPdNTP, , 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完全相同的子代分子完全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 Molecular Biology Course（一）、（一）、DNADNA的复制的复制 1、DNA半保留复制的机理半保留复制的机理 2、DNA的半不连续复制的半不连续复制 Molecular Biology Course1 1、DNADNA半保留复制的机理半保留复制的机理Semi-Con

6、servationReplicationlDNADNA作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确的自我复制，使确的自我复制，使DNADNA的量成倍增加，这是细胞分裂的的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。物质基础。l19531953年年WatsonWatson和和CrickCrick提出提出DNADNA双螺旋结构模型，模型双螺旋结构模型，模型指出，指出，DNADNA分子由两条多核苷酸链组成，两条链的碱基分子由两条多核苷酸链组成，两条链的碱基配对规则：配对规则：G G只能与只能与C C配对，配对，A A只能与只能与T T配对，以氢键相配对，以氢键相

7、连，所以两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺连，所以两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。就是说，序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。就是说，DNADNA分子的每一条链都含有合成它的互补链所需的全部信分子的每一条链都含有合成它的互补链所需的全部信息息。 Molecular Biology Coursen这就说明这就说明DNADNA的复制是由原来存在的分子为模板来合成的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链。新的链。n曾经有许多关于曾经有许多关于DNADNA复制方式复制方式的学说，包括半保留复制，的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复制等。全保留复制

8、以及分散复制等。nWatson和和Crick在提出在提出DNA双螺旋结构模型时就推测，双螺旋结构模型时就推测，DNA在复制时首先两条链之间的在复制时首先两条链之间的氢键氢键断裂开，然后以断裂开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样链，这样新合成的子代新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代分子中一条链来自亲代DNA，另一另一条链是新合成的，这种复制方式为条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制半保留复制。Molecular Biology CourseMolecular Biology CourseThree replication hypot

9、hesesn19581958年年MaselsonMaselson和和StahlStahl利用利用氮标记氮标记技术在大肠技术在大肠杆菌中首次证实了杆菌中首次证实了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。n他们将大肠杆菌放在含有他们将大肠杆菌放在含有N N1515标记的培养基中培标记的培养基中培养，得到养，得到N N1515 DNADNA。n然后将细菌转移到含有然后将细菌转移到含有N N1414标记的培养基中进行标记的培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯密度梯度离心法观察用氯化铯密度梯度离心法观察DNADNA所处的位置。所处的

10、位置。n由于由于N N1515标记的标记的DNADNA的密度比普通的密度比普通DNADNA的密度大，的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNADNA分布在不同的区带。分布在不同的区带。 Molecular Biology Course 实验结果实验结果表明：表明：在全部由在全部由N N1515标记的培养基中得到的标记的培养基中得到的N N1515DNADNA显示显示为一条重密度带，位于离心管的管底。为一条重密度带，位于离心管的管底。当转入当转入N N1414标记的培养基中繁殖后第一代，得到了标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是一

11、条中密度带，这是N N1515DNADNA和和N N1414DNADNA的杂交的杂交分子。分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为它们分别为N N1414DNADNA分子分子 和和N N1414N N1515DNADNA杂合杂合分子。分子。随着以后在随着以后在N N1414培养基中培养代数的增加，低密度培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束从管带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束从管底到管口，底到管口，CsCLCsCL溶液密度，不同重量的溶液密度，不同重量的DNA分分子就停留在于其相当的子就停留在于其相当的

12、CsCL密度处，在紫外光密度处，在紫外光可以看到可以看到DNA分子形成的区带。分子形成的区带。Molecular Biology Coursen为了证实第一代杂交分子确实是一半为了证实第一代杂交分子确实是一半N N1515DNADNA一一半半N N1414DNDNA A：将这种杂交分子经加热：将这种杂交分子经加热变性变性，对于，对于变性前后的变性前后的DNADNA分别进行分别进行CsCLCsCL密度梯度离心。密度梯度离心。n结果变性结果变性前前的杂交分子为一条的杂交分子为一条中密度带中密度带，变性，变性后后则分为则分为两两条区带，即条区带，即重重密度带（密度带（N N1515DNADNA）和和

13、低低密度带（密度带（N N1414DNADNA）。）。它们的实验只有用半保留它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。复制的理论才能得到圆满的解释。 Molecular Biology CourseMolecular Biology Course( (CsClCsCl gradient centrifuge) gradient centrifuge) N15 N14 DNADNASemi-ConservationReplicationM. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.1、DNA半保留复制的证据半保留复制的证据Mole

14、cular Biology Course 模板模板：能提供合成一条互补链所需要精确信息的：能提供合成一条互补链所需要精确信息的核酸链。核酸链。 Molecular Biology Course2 2、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制 （semi-discontinuous eplication） n在体内，在体内，DNADNA的两条链都能作为模板，同时合成出两条的两条链都能作为模板，同时合成出两条新的互补链。新的互补链。n由于由于DNADNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5 5 3 3 ，另一条链为，另一条链为3 3 5 5 。n但是所

15、有已知但是所有已知DNADNA聚合酶的合成方向都是聚合酶的合成方向都是5 5 3 3 ，而不，而不是是3 3 5 5 。n这就很难说明，这就很难说明，DNADNA在复制时，两条链如何能够同时作在复制时，两条链如何能够同时作为模板合成其互补链。为了解释这一现象，日本学者岗为模板合成其互补链。为了解释这一现象，日本学者岗崎提出了半不连续复制崎提出了半不连续复制模型模型。 。 Molecular Biology CourseMolecular Biology Course3535OK !How ?5353n19681968年，岗崎用年，岗崎用3 3H H脱氧胸苷短时间标记大肠脱氧胸苷短时间标记大肠杆

16、菌，提取杆菌，提取DNADNA，变性后用超离心法得到了许多变性后用超离心法得到了许多3 3H H 标记的，后人称为岗崎片断标记的，后人称为岗崎片断的的DNADNA。n延长标记时间后，岗崎片度可转变为成熟的延长标记时间后，岗崎片度可转变为成熟的DNADNA链，因链，因此，这些片断必然是复制过程的中间产此，这些片断必然是复制过程的中间产物。物。Molecular Biology Coursen但是冈崎等最初但是冈崎等最初不能确定不能确定DNADNA链的不连续只发生在一条链的不连续只发生在一条链上还是两条链都如此。链上还是两条链都如此。n对岗崎片断进行测定，结果测得的数据对岗崎片断进行测定，结果测得

17、的数据远超过远超过新合成新合成DNADNA的一半，似乎两条链都是不连续的。的一半，似乎两条链都是不连续的。n后来发现，这是由于后来发现，这是由于尿尿嘧啶代替嘧啶代替胸腺胸腺嘧啶掺入嘧啶掺入DNADNA造成造成的。的。DNADNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶中的尿嘧啶可被尿嘧啶DNA-DNA-糖苷糖苷酶酶切除，随切除，随后该处的磷酸二脂键断裂，一些核苷酸被水解，造成后该处的磷酸二脂键断裂，一些核苷酸被水解，造成一个缺口，最后缺口空隙被填补和修复，在此过程中一个缺口，最后缺口空隙被填补和修复，在此过程中也会产生一些类似岗崎片断也会产生一些类似岗崎片断的的DNADNA片断。片断。Molecular Biol

18、ogy CourseMolecular Biology CoursedUTPdUTP : : dTTPdTTP = 1 ：300 in cellin cell -A-T-G -C-AUGUdut gene dUTPase 少数少数dUTPdUTP DNA 中不能有中不能有U ?-A-T-突变频率突变频率 = 1/1200 ！？！？-A- -A- -U- - - Ungase ungU尿嘧啶-N-糖基酶 Molecular Biology CourseUUdenature denature dump fragmentdump fragment 1200base 1200base Okazaki

19、fragment Okazaki fragment ung dump fragment longerdump fragment longer dut dump fragment shorterdump fragment shorterAAn当用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株（当用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株（ungung- -进行进行实验时，尿嘧啶不再被切除。）实验时，尿嘧啶不再被切除。）n此时，新合成的此时，新合成的DNADNA有一半放射性标记出现于岗有一半放射性标记出现于岗崎片断中，另一股直接进入大的片断。由此可崎片断中，另一股直接进入大的片断。由此可见，当见，当DNADNA复制时，一条链是连续

20、的，另一条链复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制是不连续的，因此称为半不连续复制（semi-discontinuous replication） 。Molecular Biology Coursen前导链前导链( (leading strandleading strand) )：以复制叉向前移动的方向：以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是为标准，一条模板链是3 35 5走向，在其上走向，在其上DNADNA能能以以5 53 3方向连续合成，称为前导链。方向连续合成，称为前导链。 n滞后链滞后链( (lagging strandlagging strand) )：

21、另一条模板链是：另一条模板链是5 53 3走向，在其上走向，在其上DNADNA也是从也是从5 53 3方向合成，但是与方向合成，但是与复制叉移动的方向相反，所以随着复制叉的移动，形复制叉移动的方向相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片断，最后完成一条完整的成许多不连续的片断，最后完成一条完整的DNADNA链，链，这条链称为滞后链。这条链称为滞后链。Molecular Biology CourseDNADNA的半不连续复制的半不连续复制Molecular Biology CoursenDNADNA复制的过程可以人为地划分成复制的过程可以人为地划分成3 3个阶段个阶段: : 第一阶段第一阶

22、段为为DNADNA复制的起始阶段，这个阶段包括起复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；始点，复制方向以及引发体的形成； 第二阶段第二阶段为为DNADNA链的延长，包括前导链及随从链的链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除形成和切除RNARNA引物后填补空缺及连接冈崎片段；引物后填补空缺及连接冈崎片段； 第三阶段第三阶段为为DNADNA复制的终止阶段。复制的终止阶段。DNADNA复制的整个复制的整个过程中需要过程中需要3030多种酶及蛋白质分子参加，我们将多种酶及蛋白质分子参加，我们将在在DNADNA复制的各个阶段着重介绍它们的作用。复制的各个阶段着重介绍它们的作用。M

23、olecular Biology CourseMolecular Biology Course（二）、复制的起始阶段（二）、复制的起始阶段 1、复制的起点、复制的起点 2、复制的方向、复制的方向 3、复制的速度、复制的速度 4、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质蛋白质 Molecular Biology Course1、复制的起点、复制的起点（origin of replicationorigin of replication）n很多实验都表明：复制是从很多实验都表明：复制是从DNADNA分子上的特定部位开始分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制

24、起始点常用的，这一部位叫做复制起始点常用oriori或或o o表示。表示。n细胞中的细胞中的DNADNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组成细胞中全部基因组DNADNA的复制。的复制。复制子（复制子（The repliconThe replicon ）：DNADNA复制从起始点开始直到终复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的点为止，每个这样的DNADNA单位称为复制子或复制单元。单位称为复制子或复制单元。Molecular Biology Coursen在原核生物中，每个在原核生物中，每个DNA分子只有一个复制起点，因分子只有一个复制起

25、点，因而只有一个复制子。而只有一个复制子。n而在真核生物中，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。分子上有许多个复制子。Molecular Biology CoursenDNA复制起始点有结构上的特殊性。复制起始点有结构上的特殊性。n例如：大肠杆菌染色体例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点复制起始点Oric由由422个核个核苷酸组成，其中有苷酸组成，其中有9个核苷酸或个核苷酸或13个核苷酸组成的保守个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，蛋白识别的位

26、置，大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA是环状双链是环状双链DNA。nDNA是环状双链是环状双链DNA，它的复制是典型的它的复制是典型的型复制。从型复制。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。方向相遇时，复制就停止。Molecular Biology Course二、复制的起始阶段二、复制的起始阶段Molecular Biology CourseMolecular Biology Coursen 复制叉（复制叉（ replication fork replication fork ）：DNADNA分子中正在进行分

27、子中正在进行复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子链构成。链构成。 n大多数生物体内大多数生物体内DNADNA的复制都是从复制起点开始以双向的复制都是从复制起点开始以双向等速形式进行。等速形式进行。n少数为双向不等速或单向方式进行复制。少数为双向不等速或单向方式进行复制。Molecular Biology Course复制叉复制叉2、复制的方向、复制的方向（1 1）、定点开始双向复制）、定点开始双向复制（2 2）、定点开始单向复制）、定点开始单向复制（3 3）、两点开始单向复制）、两点开始单向复制Molecular Biology Co

28、urse（1 1）、定点开始双向复制）、定点开始双向复制 这是原核生物和真核生物这是原核生物和真核生物DNADNA复制最主要的形式，从复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链。链。Molecular Biology CourseMolecular Biology Course1、复制子、复制子（2）、定点开始单向复制、定点开始单向复制 质粒质粒colE1colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。

29、Molecular Biology CourseMolecular Biology Course（3 3）、两点开始单向复制、两点开始单向复制（3 3）、两点开始单向复制、两点开始单向复制 腺病毒腺病毒DNADNA的复制是从的复制是从2 2个起点开始的，形成个起点开始的，形成2 2个复制叉，个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。各以一个单一方向复制出一条新链。Molecular Biology Course（3 3）、两点开始单向复制、两点开始单向复制Molecular Biology Course（3 3）、两点开始单向复制、两点开始单向复制Molecular Biology Cours

30、e3、复制的速度、复制的速度有双向等速的，也有双向不等速的。有双向等速的，也有双向不等速的。 Molecular Biology Course4 4、DNA复制起始引发体的复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质形成及所参与的酶和蛋白质 （1）、DNADNA双螺旋解旋双螺旋解旋（2）、引发体的形成、引发体的形成 Molecular Biology Course（1）、DNADNA双螺旋解旋双螺旋解旋 nDNADNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉。在复制时，其双链首先解开，形成复制叉。现在已经发现一些酶和蛋白质能使现在已经发现一些酶和蛋白质能使DNADNA双链变得双链变得易于解开，或者可以

31、使超螺旋分子松弛。易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛。1）、单链结合蛋白（、单链结合蛋白（SSB） 2）、 DNA解链酶（解链酶（DNA helicase） 3）、）、DNA的解链过程的解链过程 Molecular Biology Coursen单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSB） 其作用是保证解链酶解开的单链在复制完成其作用是保证解链酶解开的单链在复制完成前保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉前保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环处，待单链复制后才掉下，重新循环.Molecular Biology CoursenDNA解链酶（解链酶（DNA helic

32、ase）DNADNA解链酶能通过水解解链酶能通过水解ATPATP获得能量来解开双链获得能量来解开双链DNADNA。 它分解它分解ATPATP的活性依赖于单链的活性依赖于单链DNADNA的存在。如果双链的存在。如果双链DNADNA中有单链末端或切口，则中有单链末端或切口，则DNADNA解链酶可以首先结解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。 大部分大部分DNADNA解链酶可沿滞后链模板的解链酶可沿滞后链模板的5 53 3方向并方向并随着复制叉的前进而移动，只有另一种解链酶（随着复制叉的前进而移动，只有另一种解链酶（RepRep蛋白）是沿着前导链

33、模板的蛋白）是沿着前导链模板的3 35 5方向移动。因方向移动。因此推测此推测RepRep蛋白和特定蛋白和特定DNADNA解链酶分别在解链酶分别在DNADNA的两条链的两条链上协同作用，解开双链上协同作用，解开双链DNADNA。 Molecular Biology CourseMolecular Biology CourseDNA helicasesnDNA的解链过程的解链过程 DNADNA在未复制前处于超螺旋结构，首先在拓扑异构在未复制前处于超螺旋结构，首先在拓扑异构酶的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，酶的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。在复制起点处解开

34、双链。 在解链过程中除了解链酶，还有一些特异蛋白，如在解链过程中除了解链酶，还有一些特异蛋白，如DnaADnaA，一旦局部解开双链，就必需有一旦局部解开双链，就必需有SSBSSB蛋白来稳蛋白来稳定解开的单链，以保证局部不会恢复成双链。定解开的单链，以保证局部不会恢复成双链。 接着由引发酶等组成的引发体会马上作用于两条单接着由引发酶等组成的引发体会马上作用于两条单链链DNADNA。不论前导链还是滞后链都需要一段不论前导链还是滞后链都需要一段RNARNA引物引物以开始子链以开始子链DNADNA的合成。的合成。Molecular Biology Course（2）、引发体（、引发体（primosom

35、eprimosome）的形成）的形成nDNADNA复制起始的关键步骤是前导复制起始的关键步骤是前导链链DNADNA的合成，一的合成，一旦前导链旦前导链DNADNA的聚合作用开始，随从链的聚合作用开始，随从链DNADNA的合成的合成也随着开始。也随着开始。n由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始只要有一段只要有一段RNARNA引物，引物，DNADNA聚合酶就能以此为起点，聚合酶就能以此为起点，一直合成下去，相对简单。一直合成下去，相对简单。n而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前

36、体由比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaBDnaB、DnaCDnaC和和单链结合蛋白组成。单链结合蛋白组成。Molecular Biology Course（2）、引发体的形成、引发体的形成1 1）、引物酶）、引物酶2 2）、引发体）、引发体Molecular Biology Coursen引物酶（引物酶（primase） 它是一种特殊的它是一种特殊的RNARNA聚合酶，可催化短片段聚合酶，可催化短片段RNARNA的合的合成，即引物的合成。成，即引物的合成。引物：是短引物：是短RNARNA片段，一般十几个至数十个核苷酸不片段，一般十几个至数十个核苷酸不等，它能与单链等，它能与单链DNADNA配

37、对，并且提供了一个自由的配对，并且提供了一个自由的3 3OHOH末端，该末端提供了由末端，该末端提供了由DNADNA聚合酶催化形成聚合酶催化形成DNADNA分子第一个磷酸二脂键的位置。分子第一个磷酸二脂键的位置。Molecular Biology CourseDNA聚合酶需要一个聚合酶需要一个3OH末端以起始复制末端以起始复制（primase）Molecular Biology Coursen引发体引发体 引发体由引发体由6 6种蛋白质种蛋白质n,nn,n,n,n,DnaB,DnaB、C C和和I I共同组成，共同组成，只有这只有这6 6种蛋白质结合在一起并与引发酶进一步组种蛋白质结合在一起并

38、与引发酶进一步组装成引发体才能发挥其功效。装成引发体才能发挥其功效。 引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上浆进，引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上浆进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNARNA短链，再由短链，再由DNADNA聚合酶三作用合成聚合酶三作用合成DNADNA，直至遇到下直至遇到下一个引物或岗崎片断为止。一个引物或岗崎片断为止。Molecular Biology CourseMolecular Biology CoursePrimosome （consists of six proteins） PriA (dual role)

39、displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primaseMolecular Biology CourseMolecular Biology Coursereplisome （2）、引发体的形成、引发体的形成Mo

40、lecular Biology Course（三）、（三）、DNA复制的延长复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子阶段以及参与的酶和蛋白质分子 1、DNADNA聚合反应和聚合反应和DNADNA酶酶2、与超螺旋松驰有关的酶：与超螺旋松驰有关的酶：Molecular Biology CourseDNADNA的复制的复制nDNADNA的复制实际上就是以的复制实际上就是以DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合聚合酶的作用下，将有力的四种脱氧单核苷酸（酶的作用下，将有力的四种脱氧单核苷酸（dATPdATP，dGTPdGTP，dCTPdCTP，dTTPdTTP，简写为简写为dNTPdNTP）聚合

41、成聚合成DNADNA的的过程。过程。 n这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多酶和蛋这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多酶和蛋白质参与，现在分别叙述它们在白质参与，现在分别叙述它们在DNADNA复制中作用。复制中作用。Molecular Biology CourseMolecular Biology CourseSubstrates required for DNA synthesis+ +n n1 1dATPdATPn n4 4dTTPdTTPn n3 3dCTPdCTP+ +n n2 2dGTPdGTP+ + +DNADNA+ +Mg2+Mg2+DNADNA聚合酶聚合酶DNADNAdAMPd

42、AMPdTMPdTMPdCMPdCMPdGMPdGMP(n(n1 1+n+n2 2+n+n3 3+n+n4 4)PPi)PPiMolecular Biology Course1、DNADNA聚合反应和聚合反应和DNADNA酶酶n19571957年，年，Arthur Arthur kornbergkornberg首次在大肠杆菌中发首次在大肠杆菌中发现现DNADNA聚合酶聚合酶I I，简写为简写为DNA DNA polpol I I。后来又相继。后来又相继发现了发现了DNADNA聚合酶聚合酶IIII和和DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII。n实验证明大肠杆菌中实验证明大肠杆菌中DNADNA复制的主

43、要过程靠复制的主要过程靠DNA DNA polIIIpolIII，而而DNA DNA polIpolI和和 DNA DNA polIIpolII在在DNADNA错配的错配的修正和修复中起作用。修正和修复中起作用。Molecular Biology Course这种酶的共同性质是：这种酶的共同性质是： 需要需要DNADNA模板模板，因此这类酶又称为依赖，因此这类酶又称为依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。需要需要RNARNA或或DNADNA作为作为引物引物，即，即DNADNA聚合酶不能从聚合酶不能从头催化头催化DNADNA的起始。的起始。催化催化dNTPdNTP加到生长中的加到生长中

44、的DNADNA链的链的3-3-OHOH末端，末端，因而因而DNADNA的合成方向是的合成方向是5 53 3三种三种DNADNA聚合酶都是聚合酶都是多功能酶多功能酶，它们在，它们在DNADNA复制复制和修复过程的不同阶段发挥作用。和修复过程的不同阶段发挥作用。Molecular Biology Course1、DNADNA聚合反应和聚合反应和DNADNA酶酶（1）、原核生物）、原核生物DNA聚合酶聚合酶（2）、真核生物）、真核生物DNA聚合酶聚合酶Molecular Biology Course（1）、原核生物）、原核生物DNA聚合酶聚合酶n1）、）、DNA合酶合酶In2）、）、DNA合酶合酶n

45、3）、）、DNA合酶合酶Molecular Biology Course1）、）、DNA合酶合酶I nDNA DNA polpol I I 是由一条多肽链组成，分子量为是由一条多肽链组成，分子量为109109KDKD。酶分子中含有一个酶分子中含有一个ZnZn2 2，是聚合活性必是聚合活性必须的。须的。 A、DNA聚合酶的聚合酶的53聚合活性聚合活性 B、DNA聚合酶的聚合酶的35外切酶活性外切酶活性校对作校对作用用 C、DNADNA聚合酶的聚合酶的5533外切酶活性外切酶活性切除修复作切除修复作用用Molecular Biology CourseMolecular Biology Course

46、nA、DNA聚合酶的聚合酶的53聚合活性聚合活性 这是这是DNADNA聚合酶最主要的活性，在引物聚合酶最主要的活性，在引物RNA 3-OHRNA 3-OH末端，以末端，以dNTPdNTP为底物，按模板为底物，按模板DNADNA上的指令由上的指令由DNApolDNApol逐个将核苷酸加上去，就是逐个将核苷酸加上去，就是DNApolDNApol的聚的聚合作用。合作用。 酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板模板DNADNA配对时才有催化作用。配对时才有催化作用。dNTPdNTP进入结合位点进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进后，可能使酶

47、的构象发生变化，促进3 3- -OHOH与与5 5- -PO4PO4结合生成磷酸二酯键。结合生成磷酸二酯键。 若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被对，无法改变酶的构象而被3-53-5外切酶活性位点外切酶活性位点所识别并切除之。所识别并切除之。Molecular Biology Course1）、）、DNA合酶合酶I Molecular Biology CoursenB、DNA聚合酶的聚合酶的35外切酶活性外切酶活性校校对作用对作用 这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切方向识别和切除不配对的除

48、不配对的DNA生长链末端的核苷酸。生长链末端的核苷酸。 这种功能称为这种功能称为校对校对功能，这是保证聚合作用的正确功能，这是保证聚合作用的正确性不可缺少的，因此，对于性不可缺少的，因此，对于DNA复制中极高的保真复制中极高的保真性至关重要。性至关重要。Molecular Biology Course1）、）、DNA合酶合酶I Molecular Biology CourseMolecular Biology CoursenC、DNADNA聚合酶的聚合酶的5 53 3外切酶活性外切酶活性切除修切除修复作用复作用5 53 3外切酶活性就是从外切酶活性就是从5 53 3方向水解方向水解DNADNA

49、生生长链前方长链前方的的DNADNA链，主要产生链，主要产生5 5- -脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。 这种酶活性只对这种酶活性只对DNADNA上配对部份上配对部份( (双链双链) )磷酸二酯键有磷酸二酯键有切割活力作用，方向是切割活力作用，方向是5 53 3。每次能切除。每次能切除1010个个核苷酸，而且核苷酸，而且DNADNA的聚合作用能刺激的聚合作用能刺激5 53 3外切酶外切酶活力达活力达1010倍以上。倍以上。 因此，这种酶活性在因此，这种酶活性在DNADNA损伤的修复中可能起着重要损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段作用。对冈崎片段55末端末端DNADNA引物的去除依赖此种外引物的去

50、除依赖此种外切酶活性。切酶活性。Molecular Biology Course DNA DNA polpol I I的的5533聚合活性和聚合活性和5533外切酶外切酶活性协同作用，可以使活性协同作用，可以使DNADNA一条链上的切口从一条链上的切口从5533方向移动，这种反应叫做缺刻平移，利用方向移动，这种反应叫做缺刻平移，利用此反应可在体外对此反应可在体外对DNADNA片段进行放射性片段进行放射性P P标记制成标记制成探针，进行核酸的分子杂交实验。探针，进行核酸的分子杂交实验。Molecular Biology Course1）、）、DNA合酶合酶I Molecular Biology

51、Course1）、）、DNA合酶合酶I Molecular Biology Course2）、）、DNA合酶合酶 n此酶分子量为此酶分子量为120120KDKD，每个细胞约有每个细胞约有100100个个酶分酶分子，但活性只有子，但活性只有DNaDNa polpol的的5%5%。n活性活性5 53 3聚合活性聚合活性3 35 5外切活性外切活性n而没有而没有5 53 3外切活性，它的作用可能与外切活性，它的作用可能与DNADNA损损伤修复有关。伤修复有关。Molecular Biology Course3）、）、DNA合酶合酶 n这是在这是在DNA复制过程中复制过程中起主要作用起主要作用的聚合酶

52、，的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有每个大肠杆菌细胞中只有1000个酶分子，但催化个酶分子，但催化dNTP参入参入DNA链的速率却是最快的，约为链的速率却是最快的，约为9000核苷酸核苷酸/每分钟每分钟/每个酶分子。每个酶分子。n这也证明这也证明DNa pol 是是DNA复制过程中主要发挥复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，进行复制时，DNA聚合酶聚合酶全酶并不是单独起作用的，而是全

53、酶并不是单独起作用的，而是与引发体等构成一个复制体与引发体等构成一个复制体(replisome)。Molecular Biology CourseMolecular Biology Course3）、）、DNA合酶合酶 n由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。制。DNa pol 是由多亚基组成的不对称二聚体，是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制它可能同时负责先导链和随从链的复制。Molecular Biology Coursen随着随着DNA DNA polpol向前移动，先导链的合成逐渐延向前移动，先导链的合成逐渐

54、延长的同时，岗崎片段也在不断延长。长的同时，岗崎片段也在不断延长。n当岗崎片段合成到前一个片段的当岗崎片段合成到前一个片段的5 5端时，这冈崎端时，这冈崎片段就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另片段就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后进行新的岗崎片段的合成。的引物，然后进行新的岗崎片段的合成。n由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。崎片段的长度。Mole

55、cular Biology Course 岗崎片段完成后，其岗崎片段完成后，其5 5端的端的RNARNA引物由引物由DNaDNa polpol的的5 53 3外切酶活性切除，由此造成的空外切酶活性切除，由此造成的空隙再由隙再由DNA DNA polpol的的5 53 3聚合活性催化聚合活性催化dNTPdNTP得得到填补。所以到填补。所以DNADNA的复制是在的复制是在DNaDNa polpol和和DNA DNA polpol互相配合下完成的。互相配合下完成的。Molecular Biology Course原核原核DNA聚合酶（聚合酶（E.coli)聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5 3

56、聚合酶活性聚合酶活性3 5 外切酶活性外切酶活性5 3 外切酶活性外切酶活性作用作用+DNA损伤的修复损伤的修复和冈崎片段之间间和冈崎片段之间间隙的填补，实践上隙的填补，实践上其产生的其产生的“缺口平缺口平移移”（nick trans-lation）技术也用技术也用于分子杂交时的核于分子杂交时的核酸分子探针的标记酸分子探针的标记+-DNA的修的修复复+-DNA复制复制中子链的中子链的延长，为延长，为主导聚合主导聚合酶酶Molecular Biology Course（2）、真核生物）、真核生物DNA聚合酶聚合酶 1）、）、DNA聚合酶聚合酶 2）、）、DNA聚合酶聚合酶 3）、）、DNA聚合酶

57、聚合酶Molecular Biology Course 2）、）、DNA聚合酶聚合酶 它能以人工合成的多聚脱氧核糖核苷酸它能以人工合成的多聚脱氧核糖核苷酸为模板，而以适当的寡聚脱氧核糖核酸链为模板，而以适当的寡聚脱氧核糖核酸链为引物合成为引物合成DNA。此酶活性水平稳定，可此酶活性水平稳定，可能主要在能主要在DNA损伤的修复中起作用。损伤的修复中起作用。 1）、）、DNA聚合酶聚合酶 是真核生物的复制酶，它在细胞内的是真核生物的复制酶，它在细胞内的活性变化与活性变化与DNA复制有明显的平行关系，复制有明显的平行关系，在细胞分裂的在细胞分裂的S期达到高峰。期达到高峰。 Molecular Bio

58、logy CourseMolecular Biology Course 3）、）、DNA聚合酶聚合酶 它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸作为模板，以脱氧核糖核酸链为引物合成作为模板，以脱氧核糖核酸链为引物合成DNA，但不是反转录酶。它在分裂细胞中但不是反转录酶。它在分裂细胞中的活性有明显的变化，细胞进入的活性有明显的变化，细胞进入S期后，它期后，它活性升高活性升高2倍，然后回到正常水平。它可能倍，然后回到正常水平。它可能在分裂细胞在分裂细胞DNA复制调控方面起作用。复制调控方面起作用。Molecular Biology Course2、与超螺旋松驰有关的酶与超

59、螺旋松驰有关的酶 DNADNA复制从起始点开始向一个方向复制时，局复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的部的DNADNA双链必须打开，主要靠解链酶的作用，双链必须打开，主要靠解链酶的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方在复制叉向前移动时造成其前方DNADNA分子所产生分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。下面的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。下面分别介绍它们的作用。分别介绍它们的作用。Molecular Biology Coursen拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变是一类改变D

60、NA拓扑拓扑性质的酶。性质的酶。n在体外可催化在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应。的各种拓扑异构化反应。n而在生物体内它们可能参与而在生物体内它们可能参与DNA的复制与转录。的复制与转录。n在在DNA复制时，复制叉行进的前方复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及于复制叉的前进及DNA的合成。的合成。DNA复制完成复制完成后，拓扑酶又可将后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。缠绕、折叠，压缩以形成染色质。 Molecular Biol