2022年抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用1

1、抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用preparation and primary application of monoclonal antibody against benzylpenicillinabstractaim: to develop monoclonal antibodymab against benzylpenicillin andto establish a sandwich elisa method for relative quantitative analysis ofthe allergen whichinduced penicillin allergy common

2、ly in clinic. methods: penicillin, as a kind of hapten, was conjugated with carrier protein to form complete antigen and then was used to immunize balb/c mice. hybridoma cells secrecting mab against penicillin were developed.ascites from the immunized mice were purified by caprylic acid. ammonium su

3、lfateprecipitation. the specificity of the purified antibodies was detected and the suitable antibodies were used for establishing sandwich elisa. results: nine hybridoma cells stably secrecting mab were prepared through cell fusion, screening and cloning, and five of these purified mab had relative

4、 highaffinity. the double.antibodysandwich elisa for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established with a sensitivity of 870u/l.the average recovery rate was 107.81% and the average intra. and inter.coefficient of varitation cv was 6.7% and 9.3% respectively. the method

5、 was applied for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein from group a streptococcus preparation. conclusion: nine hybridoma cell strains stably secreting mab against benzylpenicillin were obtained. the double.antibody sandwich elisa for relative quantitative analysis of benzylpen

6、icilloyl proteinwas established.keywordsbenzylpenicillin;benzylpenicilloyl;mab;double.antibody sandwich elisa 摘 要目的:制备抗青霉素的单克隆抗体 mab并建立双抗体夹心 elisa检测方法 , 对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行讨论；方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫 balb/c 小鼠,应用杂交瘤技术建立稳固分泌抗青霉素mab的杂交瘤细胞株；常规制备腹水 ,用辛酸.硫酸铵法纯化 ,并对纯化的 mab进行特异性鉴定；通过对不同抗体组合的分析和条件的优化 ,建立检

7、测过敏原的双抗体夹心elisa方法；结果 :经细胞融合、 挑选及克隆化 ,共获得 9 株稳固分泌抗青霉素mab的杂交瘤细胞株 ,其中 5 株亲和力较高；建立了双抗体夹心elisa 相对定量检测方法 ,该方法灵敏度达到 870u/l,平均回收率为 107.81%, 批内变异系数平均为 6.7%, 批间变异系数平均为 9.3%, 可用于 a 群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测；结论 :胜利地制备了抗青霉素的 mab, 并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心 elisa法； 关键词 青霉素;青霉噻唑基 ;单克隆抗体 ;双抗体夹心 elisa青霉素因其高效、 低毒的特点在临床上被广泛应用,但其结构

8、中的 .内酰胺环很不稳固,在溶液状态特别是碱性条件下易开环与蛋白、多肽的氨基发生亲核反应生成稳固的 青霉噻唑蛋白 ,形成临床主要的过敏原 1 ；青霉素类抗生素的过敏反应发生率居各种药物之首2,青霉素不纯物 0.0 1 g即可使青霉素高度敏锐者产生严峻的过敏反应3 ；生理条件下青霉素开环后大约95%与蛋白质共价结合形成青霉噻唑基（ benzyl penicilloyl, bpo）主要抗原打算簇 ,而其他一些共扼物如 penicillanyl, penicillenate、 青霉烯酸、 penamaldate, penaldate, d.青霉胺和 penicoyl等就为次要抗原打算簇 ,后者仅占

9、5%4 ；理论上连接有两个青霉噻唑基的蛋白、多肽就可能与 ige 分子形成桥式结构从而引发 i 型超敏反应；青霉素的这种不稳固性使得在制备过程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能残留有青霉噻唑蛋白,而目前的检测方法通常是针对游离的有抗菌活性的青霉素,尚无特地针对具有免疫原性且有潜在致敏危急的青霉噻唑蛋白的检测方法；本讨论中, 采纳杂交瘤技术制备了稳固分泌抗青霉素mab的杂交瘤细胞 ,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心 elisa法,该方法特异性强、 灵敏度高 ,有望对药品、 食品中可能残留的青霉噻唑蛋白进行痕量检测；1 材料和方法1.1 材料青霉素钾标准品 ,为本所制备 , 相对

10、分子质量（ mr）为 372.49,纯度为99.9%; 牛血清白蛋白（ bsa）、 卵清蛋白（ oa）、 多聚赖氨酸（ poly.l.lysine, pll）为 sigma公司产品 ; dmem培育液为 gibcobrl公司产品 ,新生牛血清购自杭州四季清公司;hat、 ht、 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、 ig 亚类试剂盒均购自 sigma公司, peg4000 购自 fluke 公司, bca 蛋白浓度测定试剂盒购自 pierce 公司, 所用二抗均为 jakson 公司产品, 其余均为国产分析纯试剂； sp2/0 细胞由本所细胞室供应 , balb/c 雌鼠（ 68 周龄）由本所试验动

11、物中心供应；1.2 方法1.2.1 完全抗原的制备免疫原的制备 : 参照 haan的方法 5,将 25 mg 青霉素钾溶于 ph9.6 na2co3缓冲液中 ,充分混匀后加入 5 mg 牛血清白蛋白 bsa（或卵清蛋白 oa）, 调剂 ph值至 11, 37 搅拌过夜 ,在 0.01 mol/l pbs中充分透析至透析液中不再检出有抑 菌活性；将透析物分装于 - 20储存；挑选用包被抗原的制备 :用直链结构的多聚赖氨酸（poly.l.lysine, pll）与青霉素偶联成 bpo.pll, 方法同；1.2.2 balb/c 小鼠的免疫分别用两种载体偶联的免疫原免疫小鼠,每只 20g, 皮下多点

12、及四脚掌初次免疫 ; 14 d后相同剂量腹腔加强免疫 ,每 2 周加强 1 次,加强后每隔 7 d 眼眶采血 ,分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价,于细胞融合前 3 d 尾静脉加强免疫；121.2.3 细胞融合、 挑选及克隆依据常规法 peg融合6 ；分别用 bpo.pl、l pll作为包被抗原和对比抗原（均为 1 mg/l 包被）、 工作浓度兔抗鼠二抗 , 用间接 elisa检测上清液；以免疫小鼠的血清为阳性对比 , 以 sp2/0 细胞培育的上清液为空白对比 , 以细胞培育板中未长出克隆的细胞培育液上清为阴性对比 , 选取 p/n 值最高的采纳有限稀释法进行 3 或 4 次克隆；每次克

13、隆后对扩大培育建库的细胞上清再分别用阴性对比 pll、 bsa、 oa和检测用抗原 bpo.pl、lbpo.bs、abpo.oa包被,间接 elisa检测；1.2.4 腹水诱生及 mab纯化建株细胞扩大培育后常规法制备腹水并采纳辛酸.硫酸铵法进行纯化；经仍原 sds.pag电e 泳检测纯度 , bca 试剂盒测定纯化抗体浓度；1.2.5 mab特性鉴定亚类测定 :依据 sigma 亚类测定试剂盒说明书测定；效价的检测 :采纳间接 elisa法测定；相对亲和力的比较:采纳间接 elisa法,加入倍比稀释的抗体与包被抗原反应30 min,以 mab浓度对 a450 值作图,依据反应曲线以达到 50%最大结合的 mab的浓度来比较相对亲和力； mab特异性分析 :用 western blot检测；分别将 bsa、 oa 和 bpo.bs、a bpo.oa以合适浓度进行 sds.pag电e 泳,转膜（ 15v 恒压, 20min）后脱脂奶粉封闭过夜；加入合适浓度的纯化抗体,室温孵育 1 h,洗后加入工作浓度 的碱磷酶标记的羊抗鼠二抗室温孵育45 min,充分洗涤