基于RNA-seq技术的宫颈癌与癌旁组织差异表达基因分析

1、基于rna-seq技术的宫颈癌与癌旁组织 差异表达基因分析张志珊蒋燕成陈紫萱陈婉花李爱禄李纯孝福建医科大学附属泉州第一医院摘要：目的探讨宫颈癌的发病机制。方法应用rna-seq技术分析3对宫颈癌及癌旁组 织转录组，利用生物信息方法对差异基因进行基因本体(go)分析和通路富集 性分析。结果在宫颈癌组织中发现1755个差界表达基因，其中758个基因表达 上调，997个基因表达下调。功能富集分析表明，差异基因富集于细胞粘附、dna 损伤有关的信号通路上。且宫颈癌组织中发现rab22a-bcas1等融合基因。结论 细胞粘附信号通路、rab22a-bcas1融合基因可能与宫颈癌的发生机制有关。关键词：宫

2、颈癌;rna-seq;转录组;差异表达基因;融合基因;收稿日期：2017-06-22基金：福建省自然科学基金(编号:2014j01436)analysis of differently expressed genes of tumor and adjacentnon一tumor tissues from patients with cervical cancer by rna sequencingzhang zhishan jiang yancheng chen zixuanquanzhou first hospital, fujian medicaluniversity;abstract：o

3、bjective to explore the possible pathogenesy of cervical cancer. methods rna sequencing was performed to screen the differently expressed genes of 3 pairs of cervical carcinoma and matched adjacent non-tirnior tissues. the differently expressed genes were identified with gene ontology (go) analysis

4、and pathway cnrichment emalysis. rcsuits there were a t otal of 1755 cliff ere ntly expressed genes in the samples, including 758 up-regulated genes and 997 down-regulated genes. these differently expressed genes were enriched in pathway related to cell adhesion and dna damage. moreover, rab22 a-bca

5、s1 fusion gene was found in cervical ceincer tissues. conclusion the pathway of cell adhesion and rab22 a-bcas1 fusion gene may be related to the tumorigenesis and development of cervical cancer.keyword：cervical careinoma; rna-seq; transcriptome; differently expressed gene; fusion gene;received： 201

6、7-06-22宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，人乳头状瘤病毒(hpv)的感染是引起宫 颈癌的重要因素，但并非所有感染hpv的患者都会发展为宫颈癌，只有hpv持续 感染导致细胞的基因组异常才最终导致宫颈癌的发生。本研究拟收集福建医科大 学附属泉州第一医院妇科就诊的宫颈癌患者3例，釆用rna-seq技术分析宫颈癌 组织与癌旁组织的转录组，筛选出差异表达基因，进而分析差异表达基因所涉 及的信号通路以及融合基因表达，有利于阐明宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌 特异的分子标志物，同时也为基因药物的开发提供候选的药物作用靶点。1材料与方法1.1研究对象收集福建医科大学附属泉州第一医院妇科就诊的宫颈癌患者3例

7、，术前经未经 放化疗及药物治疗，经病理组织学确诊为宫颈癌iib期，同时取癌组织和癌旁 组织(距离宫颈癌癌灶边缘3 cm),置于rna保存液中-80°c保存。1.2 rna提取及质检3对癌组织及癌旁组织分别用qiagen微量rna提取试剂盒按操作说明书提取 rna。琼脂糖凝胶电泳分析rna的纯度和完整性，nanodrop检测rna的纯度(0d 260/280比值),qubit 2.0对rna浓度进行精确定量,agilent 2100精确检测 rna的完整性。1. 3文库构建及测序 用带有oligo (d t)的磁珠富集真核生物mrna,加入fragmentationbuffer将 mr

8、ta打断成短片段，以mr-na为模板，用六碱基随机引物(random hexamers) 合成一链c dna,加入缓冲液、d ntps和dma polymerase i和rnase h合成二 链c dna,利用ampurc xp beads纯化双链c dna。纯化的双链c dna先进行末 端修复、加a尾并连接测序接头，再用ampure xpbeads进行片段大小选择。采 取pcr扩增，用ampure xp beads纯化pcr产物，得到文库。文库构建完成后，先 使用qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，使用agilent2100对文库的插入片段 进行检测，使用q-pcr方法对文库的有效浓度

9、进行准确定量，保证文库质量。文 库检测合格后，使用illumina高通量测序平台(hi scq/mi sep)进行测序。1. 4测序数据分析测序数据的质量主要分布在q30以上，才能保证后续高级分析的正常进行。将原 始数据中包含的接头(adapter)信息、低质量碱基、未测出的碱基去除，得到 最终的有效数据(clean data)。利用top hat2软件将获得的数据与参考基因 组进行序列比对，比对到指定的参考基因组上的reads称为mapped reads,利 用cufflinks软件将mapped reads进行转录本拼接，利用cufflinks软件计算 癌组织和癌旁组织基因表达量。1. 5

10、差异表达基因筛选应用cuff di ff软件进行分析，在不同样本组差异表达rna检测过程中，将fold change2且fdr0. 05作为筛选标准。差异倍数(fold change)表示两样品间 表达量的比值。1. 6差异表达基因通路富集及基因本体(go)分析应用信号通路分析软件(ipa)对2组样木差异表达基因进行信号通路富集、疾 病功能富集分析，利用软david工具进行g0分析。1. 7融合基因分析应用top hat fusion分析融合基因，tophat fusion通过将未能比对到参考基 因组的reads打碎成25 bp的片段，然后采用bowtie将25 bp的片段比对到基 因组，从而

11、找岀比对到两个染色体的片段或者比对到同一染色体不同位置的 readso2结果2.1差异表达基因分析将癌组织和癌旁组织相比，共发现1755个差异表达基因，癌组织相对于癌旁组 织样本中有758个基因表达量上调，997个基因表达量下调。2. 2 go及通路分析 1755个差异基因共富集到582条go_bp, 1755个差异表达基因共富集到378条 通路。这些差异表达的基因主要涉应粘附、dna损伤等通路。最有意义的前5条 信号通路富集结果如表1所示。表1癌组织和癌旁组织差界表达基因前5条信号通路富集结果下载原表2. 3融合基因分析癌组织屮存在的融合基因，分析结果及说明见表2。表2融合基因分析结果及说明

12、下载原表3讨论虽然高危型hpv的持续感染是引起宫颈癌的根本原因，但仅有一小部分感染者 发展为宫颈癌£11。目前众多研究证实宫颈组织基因水平上表达异常会诱发宫颈 癌的发生宜。rna-seq技术不仅能检测组织已知基因的转录活动，还能检测未 知基因rl本研究中收集福建医科大学附属泉州第一医院妇科就诊的宫颈癌患者3例，采 取rna-seq技术，共发现1755个差异表达基因，共富集到582条go种类和378 条通路，这些差异表达的基因主要涉及粘附、dna损伤等通路。排在前2位的通 路均与细胞粘附和渗出有关，而细胞粘附分子在细胞的粘附与渗出中起重要的 作用。研究显示细胞粘附分子与宫颈癌的侵袭转移

13、有密切关系。在宫颈癌的形成、 发展和转移过程中，细胞粘附分子起着至关重要的作用皿。活化白细胞粘附分 子在不同恶变程度宫颈癌屮的表达存在差异，并在宫颈癌的发生发展过程屮表 达量呈上升趋势固。因此我们推测与细胞粘附相关的信号通路可能在宫颈癌的 发生中起一定的作用。融合基因是指两个基因的编码区首尾相连构成的嵌合基因。融合基因编码的蛋白 通常具有致癌性，会影响细胞的正常生理功能，是导致癌症的主要原因之一。目 前，在肺癌、甲状腺、乳腺癌等疾病屮，都发现了融合基因的存在6-7,但是 与宫颈癌的相关性尚未见报道。本研究通过rna-seq技术检测宫颈癌组织和癌旁 组织的转录组发现，与癌旁组织相比，3个宫颈癌组

14、织中都存在不同程度的融合 基因。其中rab22a-bcas1融合基因有2个宫颈癌样木中同时存在orab22a是ras 相关的小g蛋白家族成员，是囊泡运输重要的调节因子。rab22a在包括肝癌、 黑色素瘤、卵巢癌、骨肉瘤在内的多种肿瘤中过表达吐1。乳腺癌扩增序列-1 (bcas1)位于20ql3.2区域，bcas1高表达在乳腺癌浸润和转移中发挥重要的作 用10, bcas1还参与三阴乳腺癌的发生11。此外，有研究表明，bcas1还与 前列腺癌、胃食管连接处腺癌、月夷腺癌相关12。rab22a. bcas1与宫颈癌的相 关性尚未见报道，而rab22a-bcas1融合基因以及本研究中发现的其他融合基

15、因 是否为导致宫颈癌的潜在致癌基因，在后续的研究中，我们将扩大样本量进行 进一步的验证。综上所述，我们通过高通量rna-seq技术分析宫颈癌及癌旁转录组，发现1755 个差异表达基因，这些差异表达基因富集到与细胞粘附、dna损伤等信号通路上, 且发现了 rab22a-bcas1等融合基因，推测可能与宫颈癌的发生、发展相关，为 后续进一步研究宫颈癌的发生机制提供了新的方向和思路。参考文献1 moody ca, laimins la. hunrnn papillomavirus oncoproteins:pathways totransforniationjnat rev cancer, 2010

16、, 10 (8) :550一560.2 0jcsina al, lichtcnstcin l, freeman ss, ct allandscape of genomic alterations in cervical carcinomas j. nature, 2014, 506 (7488) :371-375.3 maher ca, kumar-sinha c, cao x, et al. transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancerjnature, 2009, 458 (7234) :97一101.4 刘成红，毛熙光细

17、胞粘附分子与宫颈癌的侵袭转移j西南军医，200& 105 : 95-97.5 杨潇，王艳清，鲜舒等活化白细胞黏附分子在宫颈癌中的表达及功能研究 j医学分子生物学杂志,2016, 13 (5) :267-271.6 wu ym, su f, kalyana-sundaram s, et al. idemtification of targetable fgfr gene fusions in diverse camccrsj.cemccr discov, 2013, 36 : 636-647.7 panagopoulos i, gorunova l, bjerkehagen b, et

18、al. chromosome aberrations and hey1-ncoa2 fusion gene in a mesenchymal chondrosarcomaj. oncol rep, 2014, 32 (1) :40-44.8 zhou y, wu b, li ji1, et al. rab22a enhemces cd147 recycling and is required for lung canccr cell migration and invasionj. exp cell res, 2017, 357 (1) :9-16.9 su f, chen y, zhu s, et al. rab22a overexpression promotes the tumor growth of melanomaj. oncotarget