细胞基本培养技术PPT课件

1、第1页/共96页玻璃器皿、胶塞、塑料制品玻璃器皿、胶塞、塑料制品第2页/共96页第3页/共96页 清洗：自来水洗，烘干 泡酸 自来水洗 去离子水洗 三蒸水洗 烘干 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。 酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾第4页/共96页第5页/共96页第6页/共96页第7页/共96页第8页/共96页第9页/共96页第10页/共96页第11页/共96页第12页/共96页二、包装：二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。 包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！ 第13页/共96页各种用品的包装器皿的包装分为半包装和

2、全包装器皿的包装分为半包装和全包装 培养瓶培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。 吸管吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。 青霉素小瓶青霉素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。倒扣在饭盒中，全包。 滤器滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。好。 大的容器大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。如锥形瓶，加上棉塞后半包装。 枪头、枪头、EPEP管管 装在相应的盒子中，全包。装在相应的盒子中，全包。 手术器械手术器械 放在饭盒中，全包。放在饭盒中，全包。 离心管离心管 加盖子后全包加盖子后全包第

3、14页/共96页三、消毒、灭菌三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。 消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。第15页/共96页无菌germ free：没有活菌。防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素 第16页/共96页1 1、消毒灭菌的方法 物理方法: : 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法

4、杀灭或去除微生物。 化学方法: :使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 第17页/共96页2、消毒灭菌的注意事项 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160，保持90120 min方能杀死芽孢。注意！消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。第18页/共96页湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。 注意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。 2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！ 关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。第19页/共96页3、一般物品：布类、金属器械、玻

5、璃器皿等消毒的要求是 15磅 20 min； 常规使用液体：消毒 15磅 15 min 。4、橡胶和塑料用品 ： 如滤器、EPEP管、离心管等高压1010磅15 min15 min。 第20页/共96页紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为3030分钟2 2小时左右。过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。第21页/共96页3、常用设施的消毒及灭菌 培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸 台面：紫外线照射、 70%乙醇擦拭 培养箱：新洁尔灭擦拭 培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌 滴管、枪头等：装载相应的容器

6、中用报纸包好高 压蒸汽灭菌 培养板：紫外线照射12小时以上。 培养基：过滤除菌、 第22页/共96页第二节 培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片。 如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。第23页/共96页2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒20 一30 分钟即可；操

7、作室空间大，需消毒3050 分钟。 在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。 紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果第24页/共96页3、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。75酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2的新洁尔灭洗涤消毒。 进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。第25页/共96页二、火焰消毒： 在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以

8、后操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。 已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。 消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。第26页/共96页三、培养操作注意事项1、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。2、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。3、布局： 原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在

9、左侧，酒精灯置于中央(图4-1)。工作由始至终要保持一定顺序性。第27页/共96页第28页/共96页4、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5、培养用瓶开瓶以后，皆应保持45 度斜位或平放， 吸取营养液BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。第29页/共96页第三节 基本培养操作技术第30页/共96页一、传代培养法 当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满

10、一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。80% 汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代？第31页/共96页1、贴壁细胞传代第32页/共96页贴壁细胞第33页/共96页贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板第34页/共96页+ + + + + + + + + + +细胞的贴附过程贴附物质带正电荷细胞带负电荷第35页/共96页成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层第36页/共96页 材料和试剂 Hela细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 EDTA消化液（0.02%） 培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）

11、、弯头毛细滴管、废液缸第37页/共96页图5-6 消化法传代培养步骤第38页/共96页 【程序】(1)吸除培养瓶内旧培养液；(2)向瓶内加入EDTA 混合液少许，以能覆满瓶底为限；(3)置温箱中25 分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；(4)吸除消化液第39页/共96页(5)用吸管吸取营养液（已经加入双抗并调好pH值）加入培养瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；(6)计数板计数后(如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。第40页/共96页2

12、、悬浮细胞的传代培养第41页/共96页悬浮生长型细胞第42页/共96页第43页/共96页 材料和试剂 HL-60细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头毛细滴管、废液缸第44页/共96页二、操作步骤l、 选生长良好的HL-60细胞一瓶 轻轻加入等量的生长液。2 、用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。3、如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。第45页/共96页二、初代培养法 意义： 初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，

13、具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，在一定程度上能反映体内状态。 初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好； 初代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。第46页/共96页1、原则： 幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养； 分化程度低的组织比分化程度高的容易生长； 肿瘤组织比正常组织容易培养。 一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。（一）取材第47页/共96页 注意事项： 取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1 立方厘米左右的小块，置于培养液中，4贮存；存放时间不宜超

14、过24 小时。 从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500 1000 单位毫升的青、链霉素BSS 液，漂洗5 10 分钟后再做培养处理。第48页/共96页1、鼠组织取材各种组织取材第49页/共96页2取皮肤： 人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切取l 2cm2 皮肤，即满足培养要求。 取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用75酒精擦拭消毒2 3 次(勿用碘酒)。 取材方法可按如下两种方法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2 毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径

15、2 3 毫米小片，深度以创面微见血迹为度；二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤表面，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。第50页/共96页3取体液： 血液白细胞是常用的培养材料，一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢复很快不易感染。从手指取2 3 滴血即够一次培养，血用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸出血后拔掉针，立即把血注入无菌容器中备用。 取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关科室，按不同手术规程取材。第51页/共96页（二）组织的分离 目的：为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使

16、细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。 分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种；第52页/共96页1离心分离法 培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用低速500 1000 转分速度，离心5 10 分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。第53页/共96页淋巴细胞分离法 原理：淋巴细胞分层液(Lyphocyte Separation Medium) 效果很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分

17、层液适用于分离血中淋巴细胞。(1)取抗凝血若干毫升；(2)按1:1 加入无菌分层液(滤过除菌)后，800 1000 转离心；(3)无菌分离出白细胞(白细胞位于红细胞上层，呈微白色)；(4)BSS 漂洗1 2 次，可用于培养或其它实验。 注意：如用动物血(如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为l.080 左右，需用相应比重的分层液。第54页/共96页2机械分散法： 切割分离法：在进行组织块培养时，可采用剪切法，一般多剪切成1 mm3 大小的块。具体操作如下：第55页/共96页 无菌切取1 cm3 组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪(剪柄较长为好)伸入容

18、器中，反复剪切组织至1mm3 大小为止(成糊状)。然后用吸管吸取Hanks 液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并再补加3 5 毫升Hanks 液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、余下组织块即可用于培养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。第56页/共96页压挤法第57页/共96页第58页/共96页3消化分离法： 组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。第59页/共96页

19、1消化培养法(单细胞培养）(三)原代细胞培养类型第60页/共96页(1)准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响； (2)处理组织：把组织块置入烧杯中，用Hanks 液漂洗23 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060 分钟；(3)剪切：用眼科剪把组织块切成23 毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；第61页/共96页(4)消化：加入比组织块总量多3050 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶

20、塞；或用恒温水浴，或置) 37温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。第62页/共96页(5)分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化)；低速(5001000 转分)离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks 液洗脱一两次后，再加入培养液)；第63页/共96页(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大

21、多数细胞来说，pH 要求在7.27.4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整；(8)培养：置入36.5度 温箱培养；如用CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。第64页/共96页第65页/共96页2、组织块培养法:第66页/共96页第67页/共96页 【程序】(1)剪切：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks 液漂洗23 次以去掉表面血污，吸净Hanks 液，用眼科剪反复剪切成lmm3 块为止；(2)摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相

22、互距离为0.5cm 为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布2030 块；(3)轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5温箱2 小时左右(勿超过4 小时)，使小块微干涸；第68页/共96页(4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46 度斜持培养瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组织小块附着尚不牢，注意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。第69页/共96页三、三、 细胞计数细胞计数 一、原理一、原理 细胞计数结果以细胞数/ /毫升表示。细胞计数

23、的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。 用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。第70页/共96页二、仪器、用品与试剂二、仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管 2 2、试剂：0.40.4台酚兰( (台酚兰 0.40.4克 加双蒸水至100ml)100ml)3 3、材料：细胞悬液( (细胞悬液的制备：用毛吸管吸5 5滴细胞悬液到一小试管中，加入1 1滴台盼蓝染液（0.40.4）或苯胺黑，

24、混匀，静置2 23min,3min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。) )第71页/共96页三、操作步骤三、操作步骤 1 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3 3、静置3 3分钟。 4 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （ 四个大格子细胞数/4)/4)稀释倍数10104 4 /ml /ml第72页/共96页说明： 公式中除以4 4因为计数了4 4个大格的细胞数

25、。 公式中乘以2 2于染液是1 1：1 1稀释。 公式中乘以10104 4因为计数板每一个大格的体积为： 1.0mm1.0mm（长）1.0mm1.0mm（宽）0.1mm0.1mm（高）0.10.1mmmm3 3 而 1ml1ml10001000mmmm3 3 。四、细胞计数要点四、细胞计数要点1.1.要求悬液中细胞数目不低于10104 4个/ml/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 第73页/共96页 3.3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4. 4. 数细胞

26、的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 5. 5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 第74页/共96页五五、初学者易犯的错误：、初学者易犯的错误： 1. 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁 边的槽中。第75页/共96页细胞计数原理第76页/共96页第77页/共96页四、 细胞冻存1原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变

27、化，最终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚矾(DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。 当前最常用的保护剂仍为甘油和DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5 15之间，常用10。第78页/共96页2要点: 为保持细胞最大存活率， 一般都采用慢冻快融的方法。第79页/共96页各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，另外用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20

28、 30甘油中很好。原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。第80页/共96页第81页/共96页 程序(1) 细胞处理：选对数生长期细胞；收集细胞24 小时前换液一次；(2)冻存液：先用培养液9 分+ DMSO 1 分(或甘油)配成10的DMSO 冻存液；按按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达107ml (一般用4瓶细胞)， (4) 分装：分装入无菌冻存管中，每管加1.5 毫升细胞悬液；(5) 封口：拧紧冻存管盖，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察；第82页/共96页（6）入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人

29、；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌， 注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；(7) 冻存：当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法：4 1h、-20 2h、85 1h、从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按-1 -12分钟速度，在30 40 分钟内，下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。 注意： 操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮伤人；细胞注入安瓶中后一定封严，最好使用塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。第83页/共96页五、冷冻细胞复苏方法第84页/共96页 程序(1) 从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因末封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅速气化而发生爆炸(力量有限)，

30、因此应带防护眼镜和手套；(2) 迅速放入盛有36 37水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内溶解；(3) 用70酒精擦试消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml 培养液，吹打使细胞悬浮；第85页/共96页(4) 低速离心(500 1000 转分) 5 分钟。(5) 去上清，加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。 注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10 倍或1：20 倍的稀释(细胞数毫升)；一般每瓶细胞接种浓度为5105m1，因此冻存密度应达到107ml，在稀释20 倍时，仍能保持5105m

31、l 数量。第86页/共96页六、细胞运送 一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；第87页/共96页二为充液法：(1) 选生长状态良好的细胞，待达80或90汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；(2) 妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；(3) 到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37培养，次日传代。第88页/共96页七、收到细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情

32、形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 1）依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。2）FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。 第89页/共96页3） 将培养基置于37 C 水槽中回温，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。 4） 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混合均匀，放入 37 ，5 % CO2 培养箱培养。 第90页/共96页5）对绝大多数细胞而言，1