5-吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析

1、5"引跺甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析摘要通过rp-hplc同时检测酶水解反应前后底物弓陈甲基海因及产物 d氨甲酰色鈔酸的含量变化,不仅可以检测海因酶的活性，还能分析酶反应过 程的转化效率。采用merck公司的purospher star rp-c18e色谱柱(4.6 mmx250.0 mm,5(im),以乙腊20 mmol/l磷酸二氢钾缓冲液(体积比25 : 75)为流动相，磷酸 调ph值为3.0,流速为1.0 ml/min,柱温为30 °c,检测波长为220 nm,于10 min内 很好地实现了各组分的分离。采用外标法进行定量分析,d色氨酸、5卿味甲基 海

2、因和d氨甲酰n色氨酸的线性范围分别是0.101.00 mg/ml(r=0.999 1)、 0.202.00 mg/ml(r=0.998 9)、0.202.00 mg/ml(r=0.998 9);酶反应体系中 5引味甲 基海因和d氨甲酰n色氨酸的加标回收率分别为99.3%100.2%和 98.0%99.3%,精密度分别为0.51%0.87%和0.43%0.94%。试验结果表明该法快 速简便、准确可靠。关键词高效液相色谱；5 网味甲基海i大l;d 氨甲酰n 色氨酸;d色氨酸highperformanceliquidchromatographicanalysisof5-(3-indolylmethy

3、l) hydantoinandltsproductsconvertedbyengineeredbacteriaqian kaixu lin*yan ming(college of biotechnology and pharmaceutical engineering,nanjing university of technology,nanj ing jiangsu 210009)abstractthe hplc method was used to detennine the concentrations of substrate 5-(3-indolylmethyl)hydantoinjn

4、termediate product n-carbamyl-dtryptophan and product d-tryptophan in the reaction solution. the sample was determined using a purospher star rp-c18e column(4.6 mmx250.0 mm,5 |im particle size)at the temperature of 30 °c with the mobile phase of acctonitrilc-20mmol/l sodium acetate(25 : 75 by v

5、olume)which adjusted to ph 3.0 with phosphoric acid at a flow rate of 1.0 ml/min the detection wavelength was set at 220 nmunder these conditions,the components in the reaction system were separated completely within 10 min. a good linear relationship was obtained by employing external standard meth

6、od for quantitative analysis. the linear calibration ranges for the three target analytes were 0.101.00 ing/ml(r=0.999 1),0.202.00 mg/ml(r=0.998 9)and 0.202.00 mg/ml(r=0.998 respectively. the recoveries of the analytes from spiking experiments were 99.3%102.0% and 98.0%99.3%,respectively,with the re

7、lative standard deviation being 0.51 %0.87% and 0.43%0.94%,respectively. the results showed that the method was rapid.convcnicnt and accuratekeywordshplc;5-(3-indolylmethyl)hydantoin;n-carbamyl-d-tryptophan;d-tryptophan海因酶是能够催化水解海因及其衍生物内酰胺键的一种环酰胺酶(ec 3.5.2)。根据海因酶作用底物的特异性和产物的光学活性的不同，可以将海因酶分 为l型、d型和dl

8、型。海因酶在工业上的应用价值主要是用来生产l型和d 型氨基酸，其作用机理是在l型或d型海因酶的催化作用下，使5匸单取代海因开 环形成相丿应的l型或d型氨甲酰类氨基酸产物，进而通过化学或iw促降解反应牛 成l型或d型氨基酸。非天然d氨基酸及其衍生物是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂、杀虫 剂以及拟除虫菊酯的重要中间体12,特别是作为半合成抗生素的侧链原料，在医 药领域具有十分广泛的应用价值。利用海因酶法制备d色氨酸具有光学纯度高、 环境污染少、反应温和、操作简单、成本低廉等优点，并能实现一些化学合成难 以进行的反应，口益受到国内外学术界与产业界的关注37。随着当代生物技术 的发展，基因工程、细胞

9、工程、酶工程等新技术的注入，微生物转化的发展已经具 有了高度的研究价值以及广阔的实际应用前景。在海因酶法催化合成d色氨酸的过程中,首先以5引味甲基海因为前体，经 d海因酶(dhase)催化其开环水解生成相应的d氨甲酰色氨酸，然后在d氨甲 酰基氨基酸水解酶(dcase)的催化下生成d色氨酸。为了更好地开展海因酶法制 备d色基酸的研究，有必要建立一种可以同时测定酶转化液中海因及其转化产物 和屮间产物的检测方法,以便更好地研究上述2个关键酶的催化机制和催化效果, 进而及时学握并调控整个反应的进程。现冇的5引味甲基海因和d氨甲酰 色氨酸的检测方法多为光谱学分析方法或质谱法8,检测d色基酸的方法多为比

10、色和层析法等。这些方法在海因酶法制备d色基酸的研究检测过程屮，不能满足 监控整个反应进程的需要。随着液相色谱技术的发展和研究，采用高效液相色谱 (hplc)对海因和氨甲酰类氨基酸进行分析的方法逐渐成熟9-10,但关于5口引喙 甲基海因和d氨甲酰n色氨酸的hplc检测方法还鲜见报道。本文建立的高效液相色谱法，不仅能准确测定5卩引喙卬基海因和d氨卬酰 色氨酸的含量，且产物d色氨酸也能同时得到分离和测定。该方法能够快速完 成酶催化反应屮底物和产物的定量分析，为生产和研究海因及其酶转化产物提供 良好的检测和分析平台。1材料与方法1.1试验仪器与试剂仪器主要有:戴安ultimate 3000液相色谱仪，

11、配有戴安lpg-3400溶剂泵;戴安vwd-3400紫外可调波长检测器;戴安wps-3000sl 口动进样器及chromeleon数 据处理软件。试剂主要有:d氨甲酰n色氨酸、5期味甲基海因、d色氨酸均由南京工业 大学生化重点实验室提供（纯度人于99.5%）;乙睛,hplc级,tedia company;水均为 二次蒸懈水;磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其他试剂均为分析纯。工程菌 rosettapet-hyuh由南京工业大学生化重点实验室构建保存。1.2色谱条件色谱柱:merck purospher star rp-c18e（4.6 mm><250.0 mm,5（im）;流动相:乙

12、 膵20 mmol/l磷酸二氢钾（体积比25 : 75）,用磷酸调ph值为3.0;流速为1.0 ml/min;检测波氏为220 nm;柱温为30 °c,进样量为10 yl。1.3标准溶液的配制准确称取d色氨酸、d氨甲酰n色氨酸、5卩引味卬基海因标准品各0.01 g, 分别加入适量的0.05 mmol/l磷酸二氢钾磷酸氢二钾缓冲溶液（ph值&0）,然后 与等比例的乙醇混合溶解,最后用10 ml容量瓶定容。用移液枪分别从上述d色氨酸、d烦甲酰n色氨酸、5引喙甲基海因的标 品溶液中吸取1、2、2 ml到新的容量瓶，然后用0.05 mmol/l ph值8.0的磷酸 缓冲乙膳（1 :

13、1）稀释定容至10 ml作为标准溶液，使混合液中d色氨酸、d氨甲 酰n色氨酸、5"弓|口朵甲基海因的质量浓度分别为0.1、0.2、0.2 g/lo1.4样品的制备接种工程菌rosetta pet-hyuh于5 ml含100 pg/ml氨节青霉素和34 pg/ml 氯霉素的lb培养基,37 °c.200 r/min摇床培养12 h,按2%的接种量转接于30 ml 发酵培养基，培养2 h后加入微量诱导剂于16 °c 200 r/min诱导培养16 h,离心 收集菌体。取适量菌体rosetta pet-hyuh,加入质量浓度为1 g/l的底物5引味甲基 海因（0.05

14、mol/l k2hpo4-kh2po4缓冲液ph值&0）充分混匀，置于50 °c水浴摇 床反应，依次取反应时间为0.5、1.0、2.0 h的酶转化液,每次取500 pl,再加入500 pl等体积的乙醇稀释,12 000 r/min离心5 min,取一上清液，经0.22（im的尼龙膜过滤 后供hplc分析。2结果与分析2.1检测波长的确定用移液枪吸取100此标准溶液稀释至3 ml,用vwd3400型紫外可见分光 光度计（波长范围190900 nm）对稀释后的标准样品进行扫描,发现在210 nm附近 冇较明显的吸收峰,用戴安ultimate 3000在上述冇吸收峰的波长下分别进样

15、2 pl 检测,发现在220 nm处的检测峰面积和峰高最大、最佳，故选用波长220 nm作为 检测波长。各物质在不同检测波长的响应值如表1所示。2.2流动相的选择由于乙購在220 nm的低波长卜噪咅小，所以背景干扰小于其他有机溶剂，且 洗脱能力强，故选用乙腊/水系统作为流动相。按照乙膳浓度的不同配比从5%到 40%,采用乙膳磷酸二氢钾流动相，磷酸调ph值为3.0,流速为l.oml/mino在检测 波长为220 nm.柱温为30 °c的液相条件下分别对标准溶液进行检测，发现当乙 腊浓度低于15%时,6氨甲酰小色氨酸和5酬竦甲基海因的保留时间十分接近, 不能将各个组分很好地分离，且分析时

16、间较长。为了缩短分析时间，逐步提高乙月青 的浓度，结果保留时间明显缩短，而且分离效果也得到改善，最佳浓度配比为 25%（图1）0但当乙膳浓度超过30%时,由于出峰时间太快，不利于各组分的分离。2.3ph值的影响为了调整各色谱峰的间距和峰形，进一步提高柱效和测量的糟确度，用磷酸分 别调节乙膵20 mmol/l磷酸二氢钾缓冲液（体积比25 : 75）的ph值为5.0、4.5、 4.0、3.5、3.0和2.5。结果显示,ph值越低色谱峰的峰形越好，柱效越高，因此选择 ph值3.0作为最佳色谱条件（表2）。2.4线性关系将配置的标准溶液分别进样2、4、6、8、10、15、20pl金hplc在1.2所

17、述条件下进行检测,每个重复测定3次，测定的峰面积取平均值。以峰面积为横坐 标x、质量浓度为纵坐标y,绘制标准曲线得到线性方程，如表3所示。2.5酶转化液中各组成的色谱分析工程菌rosetta pet-hyuh是南京工业大学生化重点实验室构建保存的具有 d海因酶活性,能水解5川引味甲基海因转化为d氨甲酰n色氨酸的工程菌。通过 考察不同反应时间（0、0.5、1.0、2.0 h）酶反应液的色谱图可以发现，随着反应时间 的延长，底物5口引喙甲基海因（保留时间为&28 min）不断被消耗产物d氨卬酰 色氨酸（保留时间为6.43 min）逐渐积累,且减少量与增加量基本同步（图2）。对照 为未进行5

18、0 °c酶解反应就立即收集菌体的上清液。结果表明，在2.22 min和2.49 min（出峰时间）处的峰可能是菌体自身代谢的其他产物，含量甚微。另取1 ml菌 液，加入最终浓度为1 g/l的底物（5卩引味甲基海因）反应4 h,d氨甲酰n色氨酸的 转化率可达98.7%o由于构建含有d氨甲酰水解酶（dcase）的工程菌的工作还在进行屮，希望能 很快将本方法运用到工程菌dcase活性的测定中。2.6回收率和精密度取4份反应吋间均为2.0 h的阳促反应液200 pl,其屮1份作为木底,依次在 余下的3份酶反应液中加入低、中、高3种不同浓度的标准溶液各200 pl,过膜 后按1.2所述检测方法

19、和条件进行测定，每个样品连续进样6次，按测定峰面积的 平均值进行计算,测定结呆如表4所示。从表4可以看出，该方法的回收率和精密 度良好。3结论与讨论采用 merck purospher star rp-c18e（4.6 mm><250.0 mm,5 |im）,以乙月青20 mmol/l磷酸二氢钾（体积比25 : 75,ph值3.0）为流动相，冇效地解决了海因酶法 牛产d色氨酸的牛产体系中底物、中间产物和产物含量的测定,d色氨酸,d氨甲 酰n色氨酸和5口引味甲基海因的测量线性范围分别是0.101.00、0.202.00、 0.202.00 mg/ml;d-氨甲酰n色氨酸和5引味甲基海

20、因的加标回收率分别为 99.3%102.0%及 98.0%99.3%;精密度分别为 0.51%0.87%和 0.43%0.94%。该 方法操作简便，准确度高,为该生产过程屮工艺条件的优化和过程监控捉供了一种 十分有效的方法。4参考文献1 陈建波，徐毅生物酶法制备d对轻基苯甘氨酸的研究j.生物学杂 志,2007,24（5）:8-11.2 封霞，袁静明.海111酶的催化特性及其反应机理j.微生物学通 报,2003,30（3）:95-98.3 王大慧，韦萍，欧阳平凯.d色氨酸研究进展j.化工进 展,2002,21(2):103-105.4 袁静明，封霞，赵莉霞非天然d型氨基酸生物转化屮卿的纯化及其基因序 列j.山西大学学报:自然科学版,2002,25(2):156-162.5 封霞，袁静明.海因酶的催化特性及其反应机理j.微生物学 报,2003,30(3):95-9&6 josefa