蛋白表达纯化实验步骤#(优选.)

1、蛋白表达纯化实验步骤 (待改进 )1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、RT-PCR,KOD!扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET2832等表达载体。5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒。6、 将质粒转化入表达菌株 ,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、 Rosetta gami(DE3)、BI21 codo n(DE3)等。7、蛋白的诱导表达。1) 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至 OD=0.6左右，加入IPTG浓度梯度从25卩M到1m M。 37

2、度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。2) SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的 50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。3) 将有表达的菌株10%甘油保种 保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22卩m过滤除菌的，储存浓度一般是 30%-60%,使用时自己计算用量。4) 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性 ，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆

3、尽 ,不会影响后面的表达。 2.保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。8、 包涵体检测。方案见附件29、如有上清表达 ，则扩大摇菌。1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5约5h左右，视菌种的活性而异 ,也可过夜摇菌。2）将上一步中的 8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h3h）,然后加IPTG浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注:菌液浓度要适当的浓一些 ,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动 ,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是 ,将手指放在瓶

4、底晃动 ,看不清手指为宜 ,不过此法宜受气泡影响。3）过夜摇菌 ,使用包涵体检测的温度 （18°左右 ）,转速 140rpm 左右。4）将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。加入 20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液 ,视菌液的浓度而定。可用4 支 50ml的离心管同时离心 ,但是 ,离心管要重复使用 ,用完后洗净保存。10 、超声波裂解。1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。注意:1.要冰浴。 2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部 ,尽量不要打出

5、大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。4 .正常声音为 :孜孜声 ,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因 ,要及时调整。溶液由浑浊变清透 ,由粘稠变不粘稠表明裂解完成 （后面 3000 转离 心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5超声波破碎仪工作 30分min要休息5min（即关闭总电源 开关）。注意 : 1 .如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF工作浓度为 1%。 2.如不能判断是否裂解完全 ,就按上述条件裂解60 分钟 ,60 分钟足够裂解。11、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml 离心管中。 10000

6、rpm,15min,4 °离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出 ,尽量不要倒出沉淀。 （此时可以测量一下 pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在 7.5左右。）12、纯化上清 -摸洗脱条件。1）镍柱处理。将 1ml 镍柱吸入空层析管中 ,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20卩I过柱后的样品，以备跑胶。3）分别加 20mM、40mM、60mM、80 mM 的咪唑梯度来洗

7、脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入 EP管中 ，以备跑胶。注意 :理论上是要将收集的溶液测量 280nm 处的吸光度 ，直到吸光度为零时再进行下一个梯 度的洗脱。实际上测不到零 ，怎么都会有一点的 ，上面说的量已经做够洗脱了。4）加Elution Buffer将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管,再将后面的4ml接入另外两个EP管）,留跑胶样品。5）加MES将NI柱重生。MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于 2倍体积的 20%乙醇中 ，镍柱至少能重复

8、利用 6次。 （尿素可能对 NI 柱有损伤。 ）注意 :所有溶液 使用前都要确定其 pH 是否正确 ,pH 对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液 MES 的 ph=5.0, 其余 Equilibration Buffer pH=7.8 , 上清 pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。13、跑胶验证。1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。2）跑胶顺序 :负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、 W2、 W3、 W4、 W5、 W6、W7、 W8、 W9、 E1、 E2、 M

9、ES3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min,只是图没有 160V 好看。 ）4）考马斯亮蓝染色。一般染色2h 即可。5）脱色。先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。14、纯化上清 -收集目的蛋白 1）将重生的镍柱再次平衡 （即加 Equilibration Buffer 3ml） 。2）重复步骤 12 中的操作 ,只是 wash 时只用步骤 12 中摸好的咪唑浓度洗。15、 跑胶验证。同步骤 13这次胶图要跑的漂亮一点 （用160V）,保存好。16、透析。1）配制2L透析液（配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。2）透

10、析袋 （剪 10cm 即可 ）用透析袋处理液煮沸 10min, 用 MILIQ H2O 充分洗净。3）用透析夹将透析袋夹住 （将透析袋折叠一下会夹的更牢）,将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCI）中。冰浴下轻微磁力搅拌 20min后 置入 4°冰箱 1.5h 后换液。透析 3 次即可。注意:用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。17、浓缩。1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中 ,用预冷的聚乙二醇 2000 固体包埋。2）30min 后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除 ,加入新的固体聚乙二

11、醇。3）每隔 10min 观察一次 ,一旦出现浑浊立即停止浓缩。4）透析袋用完后 ,洗净 ,保存于 20%乙醇中 4°存放。注意 :浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现,由于透析袋使溶液成薄层状 ,透明度较高 ,不易发现小颗粒或絮状沉淀 ,要看仔细。 如果看不到 ,可根据自己估计的蛋白量留 1-2ml 体积。 用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉 ,吸取其中的溶液分装后 -20 度保存。18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、 17 两步。1）将 4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。2）配平。3）7400g,30min,4。离心，结束时4ml变为1ml左右

12、。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间 ,以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution 液一起浓缩。4）加入需要的蛋白储存液至4ml, 离心。重复操作可以使Elution 液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCI或适当浓度和 pH的tris-HCI溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。5）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度 （测量后 ）,制备日期。注:超滤管的使用方法见附件419、 蛋白浓度测定。见附件320、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混

13、合成油包水状。22、注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗体。24、抗体效价评定。附件 1所需溶液配方 :1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCI pH 7.4试剂名称 NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCI用量（g）1L 0.5928 5.802192 17.5322）EquiIibration Buffer（ 平衡缓冲液 ）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.43）Wash Buffer（清洗缓冲液）:PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 p

14、H 7.44）Elution Buffer（洗脱缓冲液）:PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.45）MES（再生缓冲液）:20 mM 2-（N-morpholine）-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。即 0.3904g MES+0.5844g NaCI.6) 透析袋处理液：2%(w/v)碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7) 透析液:20mM PBS+50 mM NaCI(2.92g)试齐U名称 NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCI用量(g)1L 0.5928 5.80

15、2192 2.92gTIPS:1 4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS用500ml水将(KZmgAnil(L4 lng/rnliTig/ml0.8 mg/mlRSA【1 mg)附172p 1losp 1J44p IH2OI44p 1loup I7即11试剂溶解 取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中,作为WashBuffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分别加入适当体积的 8M咪唑。最后,定容。 Wash Buffer、Elution Buffer 各配了 100ml,Equi

16、libration Buffer 配了 300ml。 PBS配了 500ml。附件2包涵体检测1. 摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至 OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）o在离心前取 500卩l菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。2. 诱导完成后，用 2ml EP 管 6000rpm,2min,4 度，收集 10ml 菌液。1.5ml PBS （50m MPBS,300m M NaCl 重悬细菌。3. 裂解细胞。用超声波破碎细

17、胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置。4. 分离上清。5000rpm,4min,4 °除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后,10000rpm,10min,4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加 5微5*SDS loading buffer 混匀,煮沸 10min。5. 重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSIoading buffer,煮沸 10min。6正负对照的收集。离心收集正负对照菌体,0.5ml上清留下40卩I,加入10卩I5*SDSIoading

18、buffer, 煮沸 10min 裂解。7.跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体 .附件 3蛋白浓度定量测试方案1. 将染色剂稀释。稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44卩m的滤膜 过滤于另 50mI 离心管中。 （此剂量可测 4个样品。 ）2. 牛血清白蛋白（BSA标准品的制备1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml,分装为400-500卩1/支（可以 室温放置 60 天,-20 度长期保存 ）。2）将1mg/ml的BSA分别稀释成 0.2、0.4、0.6、0.8mg/m

19、l,各180卩l,另外加一管水为3. 染色。1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复，共8支,另外加1个样品（或1+n个样品）和 1个blank,共10支EP管（或 10+n 支）,分别对应标记。2）将30卩l样品和30卩l标准BSA及30卩l H2O分别加入上述 EP管中。涡旋混匀。3）室温孵育5min到60min °5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为Absorbanee wil increase over time 。4. 吸光度的测量。 600nm 处测量 ,并记录吸光度。注意 :1. bl

20、ank 是染色液加 30微升的水。2 .从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample 的浓度范围 ,据此决定 sample的测量顺序。5. 比色皿的洗涤。用 100%乙醇浸泡洗涤。6. 标准曲线的制作。利用 excel 工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。附件 4.4ml millipore 超滤离心管使用注意事项1.用前用 miliq 水润湿。2.4 度预冷。3离心力不能超过 7500g。加速度设定为 8.4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心,以使两膜所受的压力一致。5使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h,后加入1m

21、l20%乙醇保存。如果要短期保存几天 ,也可加水浸泡。附件 5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法附件6.包涵体蛋白的提纯与提上清中所用试剂不同之处 :在 Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了 6M 尿素或盐酸胍。 尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。 在裂解完后 ，离心时先 3000rpm3min 去除未裂解的细胞和大的碎片，再 10000rpm15min 离心，沉淀就是包涵体。用加了6M 尿素或盐酸瓜的 Equilibration Buffer 溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致， 只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中都含有 6M 尿素或盐酸胍。 另外