铁调素药物研究现状和应用前景

1、铁调素药物研究现状和应用前景李艳伟i赵晋英钱忠明2(1.邵阳医学高等专科学校解剖教研室邵阳4220002.香港理工人学应用生物和化学科技学系香港红砌999077)research progression and application of hepcidin related medicineli yan-wei, zhao jin-ying, qian zhong-ming(department of human anatomy, shaoyang medical college, shaoyang, 422000)关键词：铁调素；棊因重组；铁过载key words： hepcidin； ge

2、ne recombination; iron overload铁代谢紊乱引起的疾患是人类最常见的疾病，影响着数以亿计的人口。最为人们所熟知 的是，铁缺乏可引起缺铁性贫虬 而铁过多将会导致血色素沉着症。然而近十多年來的研究 表明，机体铁代谢紊乱造成的危害并不仅仅局限于此。研究表明机体或某一器官的铁过多与 多种疾病的发住有关，如脑铁过多与神经变性性疾病山，心脏铁过多与铁源性心脏病，川: 脏诙过多与肝纤维化等。原因是过量铁可促发产生大量自山基，引起组织损伤。对于机体 铁过载，常常釆用放血疗法或给予去铁破等铁螯合剂。然而，长期的跟踪调查显示，釆用铁 螯合剂或放血疗法治疗铁过载疾病并不能解决根木问题，而

3、副作川很大。因此，寻找和 开发治疗铁过载疾病的有效新药，是一项刻不容缓的任务。2001年，两个著名实验室乐6同 时发现了铁调素(hepcidin, hepc),目前被认为是人们长久以來寻找的一种负性铁调节激 素，控制着机体的铁稳态。现在已经证实hepc可与|二指肠上皮细胞和巨噬细胞表而的膜 铁转运蛋白(feitoportinl, fp1)结合，诱导fp1内吞并降解，从而减少十二指肠铁吸收和巨噬 细胞铁释放，降低血清铁含量，授终降低机体铁水平。另外hepc对肠上皮细胞、巨噬细胞 以及骨髄的其它铁转运蛋白表达也侑调节作用，这些铁转运蛋白对机体和细胞铁稳态的维持 至关重要。蹄hepc在铁代谢屮作用的

4、阐明，将其开发成为治疗铁过载疾病的新药成为人 们研究的焦点。因此木文将讨论hepc药物研究现状和应用丽景。1. hepcdin药物研究现状由于hepc是一种铁的负性调节激素，可以降低机体铁水平，因此其本身作为一种外源 性药物可以用来治疗铁过载疾病。日前hepc的获得方法主要有三种：高效液相色谱法从尿【作者简介】李艳伟(1979-),男讲师，神经生物学专业硕士，研究方向：脑铁代谢与神经退行性疾病。 液中提取、人工化学合成以及基因工程制药。1.1 高效液相色谱法(high pei*foi*mance liquid chromatography, hplc)hplc是冃前应用广泛的分离、分析、纯化冇

5、机化合物的冇效方法乙一。正常人体hepc 主要山肝脏合成后进入血液发挥作用，最后在肾脏随尿液排出体外。2001年park等首先利 用hplc从人球小分离出hepc,包含有20、22和25个氨基酸多肽三种组成形式，20和 25个氨基酸多肽是hepc的主要存在形式。后来，hplc就成为有效分离hepc的经典方 法被广为应用。2002年，笔者实验室也应用该技术从人尿液中成功分离得到hepc,并申 请了专利“hepcidin(海魄喜定)在制药中的应用"，僦将hepc用作制备治疗铁代谢紊乱 疾病的药物的静脉注射剂。但采用hplc从冰液获得hepc含量很少，尚不能达到批量生产 要求，只能满足科研

6、工作的需要，无法满足临床的应用。1.2人工化学合成人类hepc在合成过程中，首先产生1个由84个氨棊酸组成的前体多肽，包括24个氨基酸 的信号肽；然后信号肽被降解，形成含冇60个氨基酸残基的多肽；最后由于n端降解生成 不同的具有牛物活性的多肽分子。这些多肽分子由于仅仅含有20儿个氨基酸，所以采用 人工化学合成hcpc成为可能，目前国际上已经有多家研究机构可以人工合成,01o llff hepc 具有单一的发夹结构，在它的两臂间连有由8个半胱氨酸残基组成的4个二硫键，形成梯样 结构-在合成过程中主要的难度就是此二级结构的止确配对。但由于采用人工化学合成 hepc,工序繁杂，而且产最极低，只能满足

7、科研丁作的需要，同样不能达到批量生产要求, 无法满足临床的应用。1.3基因工程制药口 20世纪70年代基i大i工程诞生以来，最先应用基因丄程技术且n前最为活跃的研究领 域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便冇效地生产许多以往难以 大最获得的生物活性物质，哄至可以创造出自然界屮不存在的生物活性物质。由于hplc和 人工化学合成的局限性，目前采用基因工程技术合成重组hepc成为各国研究开发的主流， 只可惜冃前尚未冇成品面世，多数研究还在实验室进行。下面将简要对这些研究工作做一简 要介绍。1.3.1国外研究现状2006年wallace等将hepc cdna整合到pcdna3.1/

8、myc-his a表达载体，然后通过质粒 转染人胚胎瘤细胞hek-293,倾 hepc主要位于高尔基复合体，提取纯化主要得到hepc 25, 并检验其具有抗微牛:物活性阳。2008年gagliardo和他的同事成功将人和小鼠的hepc基因 整合到大肠杆菌的质粒中，hcpc以一种恢硫蛋口的形式表达在了大肠杆菌中，然后将hepc 从中分离，恢复其4个二硫键和二级结构i。此方法产生的重组hepc与天然的hepc具冇 相同的活性，可以结合巨噬细胞表面的fp1并诱导其降解，同样也具有抗微生物活性。 srinivasulu等【采用同样的方法也合成了重组h本鲫hepc。而koliaraki筹【将hepc25

9、和 hepc20基因构建质粒转染毕赤酵母菌实现了稳定表达，其中重组his-hepc25与天然形式活 性相同，具有很高的应用价值。1.3.2国内研究现状袁其朋等16-冈为了在大肠杆菌屮表达生产re”，根据人肠杆茵密码子偏好性，化学合 成了人hepc的基因序列，并构建了hepc的融合表达载体pet-hpco pet-hpc在大肠杆茵 bl21(de3)中表达的hepc融合蛋口以包涵体形式存在，其n端带有6个组氨酸。通过优化诱 导表达条件，该融合蛋白表达水平显著提鬲，占总蛋白的25.2%。表达的包涵体经1 % triton x.100洗涤后溶于8mol/l尿素，在变性条件下采川金属螯合层析进行纯化，

10、所得融合蛋白纯 度人于95%。酶切后所得重组hepc经抑菌圈试验检验，对枯草芽砲杆菌具有抗菌活性。 lc-esi-ms与园二色光谱检测显示重组hepc与天然hepc相对分子质量相同、二级结构相似。 王元忠等貯采用真核表达方式，将小鼠hepc1和hepc2基因构建到髙效的真核表达载体 pcdna3上，并实现了其在nih3t3细胞中的稳定表达。次年他们用同样的方法将hepc1和 hepc2基因的真核表达载体分别稳定转染小鼠小鼠巨噬细胞系raw264.7细胞，发现 raw264.7细胞铁储存增加了 1.65倍，而铁释放分别减少了将近一半。在笔者实验室也在 开展重组hepc的研究，本实验室利用缺陷性腺

11、病毒作为基因载体，将hepc基因重组进入腺 病毒中，以达到提高其表达量的目的。在实施方式中，选择了构建铁代谢基因的重组腺病毒, 其载体系统为adeasy-lo adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过其穿梭质粒 ad-track-cmv将外源性基因与病毒骨架整合，从而包装出具冇广泛感染性的重组腺病毒。 包装成功的重组腺病毒在一般的细胞内不能复制，具有安全、高效、简单易行等优点。目前 研究成果己经申报了国家专利，并且正在广泛开展治疗铁代谢紊乱疾病的临床前研究工作。2. hepc治疗铁过载疾病的应用前景2丄遗传性血色素沉着症遗传性血色素沉着症(hereditaryhemochromatosi

12、s, hh)是一种常染色体隐性遗传病，主 要表现为i二指肠对铁的持续过度吸收引起高铁血症和肝、脾等多器官的铁沉积，以及由此 导致的多组织器官功能障碍和衰竭。根据其突变基因的不同，主要被分为i-iv类：大多数 hh是山于一非典型mhc i类分子血色病基因(hemochromatosis gene, hfe)的c282y突变所 致的hhi型。hfe突变是怎样导致hh还不是很清楚，但近来的研究发现似乎是通过hepc 作用。以下证据支持这个说法：merryweather-clarke等的报道hfe慕因敲除所致hh小鼠肝 细胞hepc mrna水平降低；由hfe突变引起的hh患者，肝组织hepc mrn

13、a、血液和尿液 hepc水平也是降低的，而且发现hepc降低程度还与hh表型的严重程度相关；在转染hepc基 因的hfe-/-小鼠，hcpc组成性表达确实能防止hfe-/-小鼠的饮超负荷。hhii型，即青少年血 色素沉着症(juvenvile hemochromatosis, jh)是一种罕见的比hh i烈更为严重的血色素沉着 症，发病年龄早月进展迅速，jh病例都与染色体lq21上的hjv棊因突变冇关，研究显示受累 个体尿液hepc水平是降低的bl。并且有人报道在两例患有jh的家庭小发现有hepc基因的纯 合突变(93delc和166c-t),另一例jh患者存在一新的hepc基因纯合突变(c7

14、0r),231o目前已确 定人hepc基因的纯合子突变能导致jh,并把这型jh命名为hhiib型，而山hjv突变所致的 jh被命名为hhiia型，推测hepc同样在hhiia型扮演重耍角色。总z,在hh发病中均有 hepc的减少，导致了铁吸收的增加。因此，右治疗hh时，给予外源性hepc可以很好的起到 治疗作用。2.2铁相关神经变性性疾病早在1991年，钱忠明等就已经发现脑铁的失调以及铁诱导的氧化应激，是某些神经退 行性疾病帕金森氏病(pd)和老年性痴呆(ad)等的重耍诱因叫2003年，他们在“柳 叶刀"发表了一篇题为"iron misregulation in the b

15、rain: a primary cause of neurodegenerative disorders"的研究论文，对脑铁失调作为神经元退行性疾病主要诱发因素之一的观点做了详 细论述卩习。时隔4年后，他们在progress in neurobiology上再次发表文章"brain iron metabolism neurobiology and neurochemistry,更为详尽地阐述了由于基因或者其他原因引发 的铁代谢蛋白界常表达，是脑铁增高的主要原因。而增高的脑铁启动机体内级联放大机制, 最终导致神经元细胞的死亡，诱发一系列神经退行性疾病的发生。而采用降低脑铁含量

16、的方 法和药物可以达到防治铁相关神经退行性疾病的可能性川。脑铁代谢与外周铁代谢有着极其 相似的共同点，却较外周更为复杂。资料显示，hepc在脑组织表达可能有种属特异性，鲍 鱼、野鸽脑组织不表达hep,而黑鯛脑组织微量表达zechel等联合应用多种方法检 测小鼠脑组织hepc的表达，发现hepc在嗅球、皮层、海马、下丘脑、小脑、脑桥、脊髓、 背根神经结等部位均表达。人类脑组织是否表达hep尚无研究。在外周，在炎证刺激下可 以明显诱导肝脏hepc的表达，笔者实验室的研究显示由脂多糖诱导的脑炎症反应时，人脑 皮层及黑质hepc的表达升高*忙 关于hepc在脑屮的作用，国内外鲜有报道，付丽妲等研 究表

17、明，侧脑宗注射hepc,可使不同脑区脑组织fp1、二价金属离子转运体(divalent metal transporter 1,dmt1)表达改变，其作用可能因部位而不同，体外研究还发现hep可促进神经 元摄铁】。由于在外周hepc有降低机体铁水平的作用，因此它冇望成为一种治疗脑铁沉积 引起的神经变性性疾病的新药。2.3铁源性心脏病1981年dr. jerome sullivan首先提出了“铁源性心脏病假说”，认为铁储存与心脏病发病 z间存在联系，解释了男女z间冠心病(coronary heart disease, chd)发病率与死亡率的差界。 根据这个理论，女性绝经前低铁贮存使得chd患病

18、率相对较低，绝经后随铁储存增加发病 率上升。现在研究证实，心脏铁代谢与肝脏等其他器官铁代谢类似，冠心病、心肌缺血再 灌注损伤、心力衰竭、心肌梗死、心肌移植排斥反应以及阿霉索所致心脏损伤等疾病的发生 都与心脏铁过多或者机体铁过多冇关联，都可以归为“铁源性心脏病”的范围z内，因此降低 心脏过多的铁沉积可以防治这些心脏疾病的发生。早在200()年，kiause等就已经证实心 脏可以表达hepc。merle等网的研究也显示心脏表达hepc,并r缺氧和炎症刺激町以诱导 其表达升高。笔者实验室的研究证实心脏含有hepc的作用靶点fp1j因此，将外源性 hepc用于铁源性心脏病的治疗具有很大的可行性。但目前

19、谄无这方面的研究和报道，因此 这将会是今后研究的重点内容。2.4伴铁沉积的慢性肝脏疾病除hh夕卜，临床上尚冇多种导致肝纤维化的慢性肝病冇肝脏铁沉积。这些疾病包括：酒 精性肝硬化阳、慢性丙型肝炎岡、恶性肝脏肿瘤尉以及地屮海贫血昭等。一项针对非裔美 国人原发性肝脏铁沉积的发病危险因素的调查发现，酗酒、慢性丙型川:炎均是高危险因索 1361 o另外，酗酒和慢性丙型肝炎还可促进hh的发病。fi本学者fujita等长期致力于研究慢 性丙型肝炎与肝脏铁沉积的关系，发现慢性丙型肝炎患者肝脏铁沉积引起的氧化应激损你 不仅可以导致肝纤维化卩叫 而以损伤dna,使慢性丙型肝炎容易转化为肝癌i。他们 采用间断静脉放

20、血使机体损失血液的同时可以减少机体铁含最，对慢性丙型肝炎患者铁沉积 的治疗有效慢性肝病患者肝脏铁沉积的原因一直不清，占从发现hepc以來，似乎找到 了其原因所在。hmrison-findik等刑的研究表明过量饮酒可使hepc转录下调，肠道铁转运 蛋白表达增加，促进肠道铁吸收，最终导致肝脏铁沉积。pro-hepc是hepc的前体蛋白，检 测血液中pro-hepc的含量可以反应hepc的多少。nagashima等i研究发现慢性丙型肝炎患 者血清pro-hepc浓度明显下降，且在肝硬化病人中更为显著，与机体铁含量呈负相关，因 此推测川:脏hepc表达降低在慢性内型肝炎患者肝铁沉积最终导致的川纤维化的

21、发病小起作 用。后来fujita等i研究证实了这一点、,他们证明hepc的下调正是其肝脏铁沉积的原因。 在地中海贫血的研究中，tanno等也发现患者肝脏hepc表达同样下降。因此，补充外源 性hepc川來弥补患者体内hepc的不足，可以很好的降低这些慢性肝病患者的肝脏铁含量， 延缓疾病的发展及其并发症的发生。1=1前尚未见国内外研究报道，但可以预测hepc在这些 伴有铁沉积的慢性川:脏疾病屮的应用将会使治疗效果得到很人改善。3. hepc在鱼类养殖业中的应用前景冃前研究发现除了在多种哺乳动物包括人、小鼠、大鼠、牛、猪、狗等中成功克隆到hepc cdna外，在鱼类也同样发现hepc的存在，包括狼

22、缈、青编、虹缚鱼、li本稣鱼、美洲 拟鳏，大西洋鮭、斑马鱼、鲍鱼、海水养殖缈鱼和红海鯛等保j hepc在机体的作用除了作 为负性铁调节激素外，还是-类新颖的小分子抗菌多肽，属于防卫素蛋口家族，是机体天然 免疫的重要效应分子。hepc体内或体外具有抑制真菌、细菌及原牛动物牛长的作用。成熟 的hepcnj-以抑制大肠杆菌、嗜水气单他菌、绿脓杆菌和曲硯菌的生长繁殖，但对酵母菌不 表现活性。在各种促炎因了作用下hepc主要由肝脏合成，courselaud等i认为大量的hepc 随血液循环到达炎症处，与病原体细胞膜表血的特殊受体结合，破坏膜的完整性，阻断呼吸 链的进行，从而起到杀菌作用。hepc是机体尤

23、其是鱼类抵御病原微牛物入侵的第一道防线， 具有广谱的抗菌活性。根据hcpc的抗菌特性，它木身有望成为一种新型的天然抗菌药物在 鱼类养殖业中得到广泛应用。4. 小结铁代谢紊乱疾病困扰着数以亿记的患者，传统的治疗方法和药物始终不能满足临床治疗 或者并未起到很好的治疗效果，白从认识到hepc在机体铁稳态的维持屮所起的作用以來， 将其开发成相关的治疗铁过载疾病的新药，给这些患者的治疗带来的曙光。可以预测hepc 本身作为药物用于治疗铁过载相关疾病，具有很大的应用价值。成功开发hepc相关药物已 成为当今各国科学家急需解决的问题，在这一领域的研究也将会竞争激烈。相信在不久的将 来，hepc相关药物会很快

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