试验目的_临床医学_医药卫生_专业资料

1、试验n的验证液质联用分析方法（lcmsms）対受试物（hs270）在大鼠血浆中含量测左的准确性 和可重现性。遵从的原则一一该实验为非临床试验研究，按照上海睿智化学公司的标准操作规程（sops和相关方案 （sd大鼠血浆，胆汁，尿和粪便中化合物hs270含量检测的生物分析方法学验证）进行, 不完全参照中国sfda的glp管理规范來实施，并且不需耍质量保证部门的审杳。受试物信息受试物批号纯度游离成盐分子量（盐）分子量（游离）储存条件hs2702010130199.3%盐464.62391.6828摄氏 度,避光保 存内标物信息内标物维拉帕米受试物批号纯度游离成盐分子量（盐）分子量（游 离）储存条件维

2、拉帕米021m1429v100%土卜 jm.491.06454.56冷藏空口机制试验中所用的空口机制（人鼠血浆、k2edta抗凝剂）。都是由上海睿智化学公司动物实验 部门提供。设备与试剂分析仪器（lc-ms/ms）液相色谱仪、包括溶液输送泵（lc-20ad）、在线脱气仪（dgu-20a2）、自动进 样器（sil-20aht） > 控制器（cbm-20a）> 柱温箱（cto-20a）。质谱仪(api4000,美国应用生物系统公司)，电喷雾离子源(esi),串联四级杆质量 分析器。数据处理系统为analyst软件(美国应用生物系统公司，软件版木号1.5.1) o其他仪器：微量分析天平(

3、xp26,梅特勒托利多仪器上海有限公司)；涡旋振荡器(multi- tubevortexer, fisher scientific);小型台式高速冷冻离心机(5417r, eppendorf )；超 纯水机(millipere):移液器(eppenderf)。试剂甲醇(burdick&jacksom, hplc),甲酸(j&k,水为超纯水。lc-ms/ms分析方法液相条件色谱柱：ace c18-ar ,5 微米 50*2.1mm色谱流动和a为0.1%甲酸水溶液b为0.1%甲酸甲醇溶液分析时间(min)流动相a (%)流动相b (%)0.0150500.150500.55951.

4、25951.2150502.85050其他质谱条件谱条件 化合物玄q1q3dwell timedpepcecxphs270392.2100.215011610316维拉帕米（is）4553165.21504910426质谱条件离了源:电喷雾离了源q1分辨率：unitq3分辨率：unit雾化气(gasl) : 60psi气帘气（cur） ： 20psi 碰撞气（cad） ： 4辅助加热器（gas2） : 65psi 摄氏度离子源电压（is） : 5500v；离子源温度（tem）样品处理方法2、血浆样品取出后放致室温，涡旋混匀（若有需要，空门样品使川前可离心）。2、取50微升样品（标曲/质控）至1

5、.5ml离心管中.3、加入250微升内标溶液（维拉帕米甲醇溶液，空门不加内标补加相同体积甲醇）.4、涡旋混匀5、离心五分钟（14000转/分钟）.6、取一定量上清液，加到相应的96孔进样板小.7、lc-ms/ms iit样分析.溶液与样品的配置储备液溶液的配制hs270储备液a:称取一定量待测物hs270至一定体积容量瓶屮，加合适的溶剂使待 测物完全溶解后泄容，配制成一泄浓度的的储备液a（stocka）,储备液a储藏在4°c冰箱 中待用.hs270储备液b:称取一定量待测物hs270 z定体积容量瓶中，加合适的溶剂使待 测物完全溶解后定容，配制成一定浓度的的储备液b（stockb）,

6、储备液b储存在4°c冰箱 中待用.维拉帕米储备液（内标）：称取一定量的维拉帕米对照品至一定体积容量瓶屮，加合 适的溶剂使其完全溶解，配制成一定浓度的内标储备液（is stock） o内标储备液储 存在4°c冰箱中待用试验溶液的配制内标工作溶液配制：吸取一定量的维拉帕米内标至一定量体积容量瓶中。用甲醇定 容至刻度后混匀，制得浓度为50mg/m的内标工作溶液.流动相溶液配制：流动相a :吸取一定量甲酸至液相色谱屮，用量筒量取加一定量纯水，配制成0.1% 甲酸水溶液。流动相b：吸取一定量甲酸至液相色谱中，用量筒量取加一定量甲醉，配制0.1% 甲酸甲醉溶液。洗针溶液配制：用量筒量取

7、一定量甲醇至液相洗瓶中，再加入一定量超纯水，按照 "比例混合后,制得洗针溶液。标准溶液与标准曲线样品配制取一定量的hs270储备液a (stocka),用甲醇稀释成溶度为200微升/ml的标准 溶液.取一定量微升200微升/ml的标准溶液，按照1:40的比例，加入到一定量的人鼠空门 血浆中.制得溶度为5000微克/ml的标准曲线样品，取5000微克/ml的标准曲线样品， 用大鼠空白血浆依次稀释到1000> 500、100> 50、10、5、2微克/ml。如表1表1标准曲线样品配制标准样品取样样品取样浓度取样体积稀释体积最终体积最终浓度std-750005000100400

8、5001000std-6std-71000200200400500std-5std-6500100400500100std-4std-510020020040050std-3std-45010040050010std-2std-3102002004005std-1std-251004005001质控溶液与质控样品配制取一定量的hs270储备液b (stockb),用甲醇稀释成浓度为200微克/ml的质控 溶液.取一定量的200微克/ml质控溶液，按照1:40的比例，加入到一定量的大鼠空白血浆 小，制得浓度为5000ng/ml的质控样品，取5000ng/ml的质控样品，用人鼠空门血浆依次 稀释到

9、浓度为 800、200、2.5、lng/mln表 2.表2控制样品配制质控样品取样样品取样浓度（ng/ml）取样体积（微升）基质体积（微升）最终体积（微升）最终浓度（ng/ml）qc-dilutionnanananana5000qc-highqc-dilution50001608401000800qc-midqc-high800200600800200qc- ln termediateqc-mid20010070080025qc-lowqc- intermediate2510090010002.5qc-lloqqc-low2.52003005001na：不适用系统适应性配制中浓度质控样品（20

10、0ng/ml）。重复进样六针來测定系统适应性。分析物峰而积的进样重复性（%rsd）应w15%,分析物出峰时间的进样重复:性v 30秒。标准曲线的配制使用储备液a （stocka）配制标准曲线样品。最低定量下限样品的配置取6份大鼠空白血浆，按照质控样甜配制方法配制6份最低量下限样品（qclloq） o选择性样品配制空门基质样品（不加内标）取6份不同个体的空门人鼠血浆基质，按照样品处理方 法处理（甲醇溶液替换内标溶液）。零浓度基质样品（空门加内标）：取1份空门大鼠血浆，按照样品处理方法处理。系统残留空白样品配制按照空白基质样品（不加内标）配制方法配制空白基质样品。基质效应样品配制溶液样品配制：取一

11、定量的hs270储备液b用甲醇稀禅至浓度为800、2.5微克/ml, 然后按照样品处理方法处理。每一浓度水平配制6份。基质样品配制：取6份不同个体的空白大鼠血浆，以1： 5体积比分别加入甲醇溶液, 涡旋后离心5分钟(14000r/min)，取各管上淸液于各白离心管待用。取一定量的日5270储 备液配制成200微克/ml的样品。再用上清液依次稀释配制浓度为800、2.5ng/ml的样 品，然后按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。通过基质样甜于农业样品药物峰而积响应的比较评价药物的基质效应；通过基质样甜与溶 液样品内标物峰而积响应的比较评价内标物的基质效应o回收率样品的配逍基质样品配制：収

12、若干份空白人鼠血浆各50微升，分别加入250微升甲醇溶液，涡 旋后离心5分钟(14000r/min),取上清液于同一离心管混匀待用。取一定量的hs270储 备液b,配制成200微克/猛烈地质控溶液，按照1： 40的比例，加入一定量的上淸液，制 得浓度为5000ng/ml的样品，再用上清液依次稀释配制浓度为800、200、2.5微克/ml的 样品。然后按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。质控样品配制：取质控样品(800、200、2.5微克/ml)按照样品处理方法处理，每一 浓度水平6份。通过质控样品与基质样品药物峰面积响应的比较评价药物的冋收率；通过质控样品与 基质样品内标物峰而积响应的

13、比较评价内标物的冋收率。稀释质控样品的配置按照质控样品配制方法配制6份稀释质控样品(qc-dilution。5000ng/ml)，取5微升 稀释质控样品，分别加入45微升空白大鼠血浆(稀释10倍)，涡旋后按照样品处理方法 处理。准确度和精确度质控样品配制使用储备液b (stock b)配制低、中、高质控样品(qclow、qcmid、qc-high),每 -浓度水平配制6份稳定性样品配制冷冻/解冻稳定性样品：取配置好的质控样品 (qc-low、qc-mid、qc-high),每一 浓度水平配制6份。第一次冷冻须在80°c下贮存至少24小时，样品口然解冻并再次解冻, 冷冻贮存至少12小时

14、，这样的周期须重复两次，在周期之间冷冻贮存至少12小吋，在第 三周期后，样品解冻并分析。口动进样器（制备后）稳定性：将处理好的质控样品（qclow、qc-mid> qc-high）, 每一浓度水平配制6份和标准曲线样品，放置24小时后（跟设定的自动进样器温度一样） 重新进样分析。试验台稳定性（室温放置4h） : （qclow、qc-mid. qc-high）,每一浓度水平配制6 份，室温放置4h后处理并分析。长期稳定性（-80°c冰箱放置两周）；（qc-low、qc-mid、qc-high）,每一浓度水平配 制6份,储存于80°c冰箱中，两周后处理并分析。储备液稳定性（室温放置6h）:取待测物hs270储备液a （stock a）和内标储备液,室 温放置6小时，川甲醇分别稀释至hs270和内标浓度均为50ng/ml后进样分析，与玄接从 4