细胞生物学_翟中和第三章

1、细胞生物学细胞生物学第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜一、光学显微镜二、电子显微镜二、电子显微镜三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态五、应

2、用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养二、细胞工程二、细胞工程第四节用于细胞生物学研究的模式生物第四节用于细胞生物学研究的模式生物细胞生物学第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。细胞生物学一、光学显微镜一、光学显微镜（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜1、构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。细

3、胞生物学细胞生物学细胞生物学3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NA其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA：为镜口率为镜口率 sin/2，n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。思考：如何提高显微镜的分辨能力？细胞生物学表一、几种介质的折射率表一、几种介质的折射率细胞生物学显微镜的几个光学特点：显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.781.651.78，所用介质的折，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。射率越接近玻璃的越好。sin /2sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1 1；介质为空气，镜口率

4、一般为；介质为空气，镜口率一般为0.050.950.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.51.5。普通光线的波长为普通光线的波长为400700nm400700nm，分辨力数值不会小于，分辨力数值不会小于.2m.2m，人眼的分辨力为人眼的分辨力为0.2mm,0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为因此显微镜的最大设计倍数为1000X1000X。细胞生物学（二）相差和微分干涉显微技术（二）相差和微分干涉显微技术干涉干涉: :两列频率相同的光波在两列频率相同的光波在空中相遇时发生叠加，在某些空中相遇时发生叠加，在某些区域总加强，在另外一些区域区域总加

5、强，在另外一些区域总减弱，出现明暗相间的条纹总减弱，出现明暗相间的条纹或者是彩色条纹的现象叫做光或者是彩色条纹的现象叫做光的干涉。的干涉。细胞生物学相差显微镜相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。同于普通光学显微镜两个特殊之处。1 1、环形光阑（、环形光阑（annular diaphragmannular diaphragm）：位于光源）：位于光源与聚光器之间。

6、与聚光器之间。2 2、相位板（、相位板（annular phaseplateannular phaseplate）：物镜中加）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟光的相位推迟1/41/4。细胞生物学细胞生物学用途：观察未经染色的玻片标本用途：观察未经染色的玻片标本细胞生物学微分干涉显微镜微分干涉显微镜 19521952年，年，NomarskiNomarski发明，微分干涉发明，微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源，光显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经

7、时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。大理石上的浮雕。 微分干涉显微微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。中的颗粒以及细胞器的运动。 细胞生物学（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜 特点：光源为紫外线，波特点：光源为紫外线，波长较短

8、，分辨力高于普通长较短，分辨力高于普通显微镜；显微镜；有两个特殊的滤光片；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式照明方式通常为落射式。细胞生物学细胞生物学用于观察能激发出荧光的结构。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green细胞生物学（四）激光共聚焦扫描显微境（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSMLaser

9、confocal scanning microscope, LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。成立体图像。细胞生物学laser confocal scanning microscope, LCSM细胞生物学细胞生物学LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (

10、green) and the nucleus (blue)细胞生物学(五五)荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术 CFPCFP的的发射发射光谱与光谱与YFPYFP的的吸收吸收光谱有相当的重光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用叠，当它们足够接近时，用CFPCFP的吸收波长激的吸收波长激发，发，CFPCFP的发色基团将会把能量高效率地共振转的发色基团将会把能量高效率地共振转移至移至YFPYFP的发色基团上，所以的发色基团上，所以CFPCFP的发射荧光将的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是减弱或消失，主要发射将是YFPYFP的荧光。的荧光。 细胞生物学细胞生物学应用应用: :1 1、检测酶活性

11、变化、检测酶活性变化 2 2、关于膜蛋白的研究、关于膜蛋白的研究 3 3、细胞膜受体之间相互作用、细胞膜受体之间相互作用4 4、细胞内分子之间相互作用、细胞内分子之间相互作用 细胞生物学( (六六) )荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术FRAP (FRAP (光漂白后荧光恢复光漂白后荧光恢复) )就是在光漂白后对样本确定就是在光漂白后对样本确定区中的荧光恢复。区中的荧光恢复。FRAPFRAP是由没有漂白的荧光团由周围进是由没有漂白的荧光团由周围进入漂白区入漂白区FRAPFRAP的运动引起的。的运动引起的。FRAPFRAP用于测量用于测量2-2-维或维或3-3-维维分子运动的力度。分子运动包括膜或

12、活细胞内用荧光标分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。 细胞生物学二、电子二、电子显微镜显微镜（一）电（一）电子显微镜子显微镜的基本知的基本知识识1 1、电子、电子显微镜与显微镜与光学显微光学显微镜的基本镜的基本区别区别细胞生物学不同光线的波长不同光线的波长细胞生物学、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数：是指电镜处于最佳状态下的分辨率：是指电镜处于最佳状态下的分辨率电镜分辨率受电镜分辨率受制样技术制样技术的影响。的影响。细胞生物学、电子显微镜的基本构造、电子显微镜的基本构造

13、）电子束照明系统）电子束照明系统）成像系统）成像系统）真空系统）真空系统）记录系统）记录系统细胞生物学（二）、主要电镜制样技术介绍（二）、主要电镜制样技术介绍1 1、超薄切片技术、超薄切片技术电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅仅40-50nm40-50nm的超薄切片，的超薄切片，(1)(1)固定：固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水(2)(2)包埋：包埋：环氧树脂包埋环氧树脂包埋(3)切片：切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片以热膨胀或螺旋推进的方式切片(4)染色：染色：重金属（铀、铅）

14、盐染色形成明暗的黑白图象重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象细胞生物学细胞生物学细胞生物学2 2、负染技术、负染技术用重金属盐用重金属盐( (如磷如磷钨酸钨酸) )对铺展在载对铺展在载网上的样品染色；网上的样品染色；吸去染料，干燥吸去染料，干燥后，样品凹陷处后，样品凹陷处铺了一层重金属铺了一层重金属盐，而凸的出地盐，而凸的出地方没有染料沉积，方没有染料沉积，从而出现负染效从而出现负染效果，分辨力可达果，分辨力可达1.5nm1.5nm左右。左右。Negative Stained Actin细胞生物学3 3、冰冻蚀刻、冰冻蚀刻 freeze-freeze-etchingetching亦称冰冻断

15、裂。亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为膜剥下来，此膜即为复膜（复膜（replicareplica）。）。细胞生物学、电镜三维重构技术、电镜三维重构技术对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理后而展现的电子密度图。后而展现的电子密度图。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核射线晶体衍射技术

16、及核磁共振磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural BiologyStructural Biology）（主要研究生物大分）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。细胞生物学、扫描电镜技术、扫描电镜技术2020世纪世纪6060年代问世，用来观察标本表面结构。年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为分辨力为610nm610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm0.2mm，扫描电，扫描电镜的有效放

17、大倍率为镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X0.2mm/10nm=20000X。细胞生物学Scanning electron microscope（ SEM）细胞生物学工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标

18、本在固定、脱水为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。下发出次级电子信号。细胞生物学扫描电子显微镜原理扫描电子显微镜原理细胞生物学细胞生物学人类精子人类精子细胞生物学三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜scanning tunneling microscopescanning tunneling microscope，原理：原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压纳米的高

19、度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.2nm0.10.2nm，纵向可达，纵向可达0.001nm0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。细胞生物学扫描隧道显微镜原理扫描隧道显微镜原理细胞生物学第二

20、节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物转速为转速为1025kr/min1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。转速转速25kr/min25kr/min，离心力，离心力89K89K者称为超速离心机。者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达目前超速离心机的最高转速可达100000r/min100000r/min，离心力，离心力超过超过500Kg500Kg。 细胞生物学超速离心技术：超速离心技术：用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细

21、胞和细胞器。沉降顺序：核沉降顺序：核线粒体线粒体溶酶体与过氧化物溶酶体与过氧化物酶体酶体内质网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。心再行分离纯化。 细胞生物学细胞生物学密度梯度离心密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化

22、铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：分离活细胞的介质要求：1 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2 2）PHPH中性或易调为中性；中性或易调为中性；3 3）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；4 4）对细胞无毒。）对细胞无毒。细胞生物学Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation细胞生物学二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法、DNADNA经经1N1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打盐酸

23、水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与基与SchiffSchiff试剂反应。试剂反应。SchiffSchiff试剂是由碱性品红和偏重亚试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有合形成紫红色的化合物。因此凡有DNADNA的地方，都能显示的地方，都能显示紫红色。紫红色。、四氧化锇与不饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的、四氧化锇与不饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的存在，苏丹存在，苏

24、丹使脂滴呈深红使脂滴呈深红、蛋白质定性：米伦反应，重氮反应、蛋白质定性：米伦反应，重氮反应 细胞生物学三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性( (一一) )免疫荧光技术免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。技术，称为免疫荧光素技术。常用的标记物有荧光素和酶。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（免疫荧光法（immunofluorescent techniqueimmuno

25、fluorescent technique）：常用的萤）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（酶标免疫法（enzyme-labeled antibody methodenzyme-labeled antibody method）：常用）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。沉积物，从而显示出抗原存在的部位。细胞生物学间接法原理示意图细胞生物学补体结合法原理示意图细胞生物学( (二二) )免疫电镜技术免疫电镜技术又称为又称为免疫细胞化学技术免疫

26、细胞化学技术是在是在免疫组织化学技术免疫组织化学技术的基的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体

27、金标记技术三个主要发展阶段。个主要发展阶段。 细胞生物学铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。用受到一定限制。 细胞生物学酶标记免疫电镜技术酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性抗体相交联，抗原抗体反应后

28、，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经部位，酶反应产物经OsO4OsO4处理变为具有一定电子密处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。 细胞生物学胶体金标记免疫电镜技术胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体

29、的标记物，用于细胞表面和细该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：（1 1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体性不发生明显改变，可制备抗体- -胶体金、蛋白胶体金、蛋白A-A-胶体金、胶体金、卵白素卵白素- -胶体金、植物凝集素胶体金、植物凝集素- -胶体金等用于免疫电镜；（胶体金等用于免疫电镜；（2 2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清

30、晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（定位比酶反应物更精确；（3 3）胶体金标记物易于制备，并）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（可以根据需要制备大小不同（1 1150nm150nm）的胶体金，因此）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4 4）金颗粒能发射强）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5 5）胶体金经）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金或黑褐色

31、，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。 细胞生物学四、细胞内特异核酸序列的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（一）原位杂交

32、（in situin situ hybridization hybridization）用于检测染色体上的特殊用于检测染色体上的特殊DNADNA序列。最初是使用带放序列。最初是使用带放射性的射性的DNADNA探针，后来又发明了免疫探针法。探针，后来又发明了免疫探针法。细胞生物学（二）（二）SouthernSouthern杂交杂交是体外分析特异是体外分析特异DNADNA序列的方法，操作时先用限制性序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核内切酶将核DNADNA或线粒体或线粒体DNADNA切成切成DNADNA片段，经凝胶电片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，泳分离后，转移到醋酸

33、纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。苷序列。将将 R N AR N A 转 移 到 薄 膜 上 ， 用 探 针 杂 交 ， 则 称 为转 移 到 薄 膜 上 ， 用 探 针 杂 交 ， 则 称 为NorthernNorthern杂交杂交。细胞生物学五、应用放射自显影技术五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态研究生物大分子在细胞内的合成动态用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。位、排出以及合

34、成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。曝光，使乳胶感光。一般用一般用1414C C和和3 3H H标记。常用标记。常用3 3H-TDRH-TDR来显示来显示DNADNA，用，用3 3H-UDRH-UDR显示显示RNARNA；用；用3 3H H氨基酸研究蛋白质，用氨基酸研究蛋白质，用3 3H H甘露糖、甘露糖、3 3H H岩藻岩藻糖研究多糖。糖研究多糖。1414C C半衰期为半衰期为57305

35、730年，年，3 3H H为为12.512.5年。年。细胞生物学六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术（一）流式细胞术（一）流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选入计算机处理，输出统

36、计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%99%。包被细胞的液。包被细胞的液流 称 为 鞘 液 ， 所 用 仪 器 称 为 流 式 细 胞 计 （流 称 为 鞘 液 ， 所 用 仪 器 称 为 流 式 细 胞 计 （ f l o w f l o w cytometercytometer）。）。细胞生物学细胞生物学（二）显微分光光度测定技术（二）显微分光光度测定技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲

37、线。曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。和定量测定。细胞生物学七、七、PCR PCR 技术技术PCRPCR即：即：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction。反应体系：样品反应体系：样品DNADNA；引物（；引物（primerprimer），约），约15-2015-20个核苷酸；个核苷酸；4 4种种dNTPdNTP；Tag DNATag DNA聚合酶，来自于嗜聚合酶，来自于嗜热水生菌热水生菌Thermus aquaticusThermus aquaticus，最适作用

38、温度，最适作用温度75807580，短时间在短时间在9595下不失活。缓冲体系和下不失活。缓冲体系和MgMg2+2+。反应过程：变性：约反应过程：变性：约90-9590-95；复性：约；复性：约6060左左右；延伸：右；延伸：70-7570-75；重复；重复 “变性变性复性复性延伸延伸” 过程过程20-3020-30次循环。次循环。细胞生物学PCR原理细胞生物学第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养群体培养（群体培养（mass culturemass culture）：将含有一定数量细胞的悬）：将

39、含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluenceconfluence）后形成均匀的单细胞层；后形成均匀的单细胞层；克隆培养（克隆培养（clonal cultureclonal culture）：培养高度稀释的细胞悬）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。为克隆。转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。 细胞生物学原

40、代培养原代培养 （primary cultureprimary culture）：即：培养直接来）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（外一个培养瓶称为传代或传代培养（PassagePassage）。）。细胞株（细胞株（cell straincell strain）：从原代培养细胞群中筛选）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。出的具有特定性质或标志的细胞群。细胞系细胞系（cell linecell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程

41、中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克隆（克隆（cloneclone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞生物学细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中常用的几种细胞系实验室中常用的几种细胞系细胞生物学（二）植物细胞培养（二

42、）植物细胞培养1.1. 外植体培养外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。代谢产物。2.2. 悬浮细胞培养悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。养，制取植物代谢产物。3.3. 原生质体培养原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：培养脱壁后的细胞，特点： 比较容易摄取外来的遗传物质，如比较容易摄取外来的遗传物质，如DNADNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞；便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 适宜条件下可产生细胞壁

43、，经诱导分化成完适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。整植株。4.4. 单倍体培养单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。植株。细胞生物学Animal Cell Culture细胞生物学二、细胞工程二、细胞工程（一）细胞融合（一）细胞融合通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（细胞的过程称为细胞融合（cell fusioncell fusion）或细胞杂交。）或细胞杂交。同核体同核体：相同基因型的细胞融合而成。：相同基因型的细胞融合而成。异核体：异核体：不同基因型

44、的细胞融合而成。不同基因型的细胞融合而成。自发融合：自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇）、化学方法（聚乙二醇PEGPEG）、物理方）、物理方法（电击和激光）。法（电击和激光）。细胞生物学单克隆抗体技术单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分

45、泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人体。于是英国人KohlerKohler和和Milstein 1975Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获单克隆抗体技术，获19841984年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。细胞生物学（三）细胞拆合与显微操作技术（三）细胞拆合与显微操作技术、物理法：、物理法：用机械方法或短光波把细胞核去掉或使用机械方法或短光波把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入

46、去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。、化学法、化学法：用细胞松弛素：用细胞松弛素B B处理细胞，细胞出现排处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两部分，由于核体外表包有一层细胞质膜胞质体两部分，由于核体外表包有一层细胞质膜和少量的胞浆，因而在和少量的胞浆，因而在PEGPEG或仙台病毒的介导下，或仙台病毒的介导下，核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。细胞生物学第四节用于细胞生物学研究的模式生物第四节用于细胞生物学研究的模式生物生物学家通过对选定的生物物种

47、进行科学研究，生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有用于揭示某种具有普遍规律普遍规律的生命现象，此时，这的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。比如，孟德尔种被选定的生物物种就是模式生物。比如，孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，而摩根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，而摩根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。 细胞生物学模式生物的特点有模式生物的特点有: :1)1)生理特征能够代表生物界的某一大类群。生理特征能

48、够代表生物界的某一大类群。2)2)容易获得并易于在实验室内饲养繁殖。容易获得并易于在实验室内饲养繁殖。3)3)容易进行实验操作容易进行实验操作, ,特别是遗传学分析。特别是遗传学分析。4)4)个体较小个体较小, ,生长繁殖快生长繁殖快。生命科学研究中常用的模式生物有：生命科学研究中常用的模式生物有：病毒，细菌，酵母，原生动物，黏菌，蛙，海胆，病毒，细菌，酵母，原生动物，黏菌，蛙，海胆，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠细胞生物学、病毒：、病毒：）特点：）特点：结构简单（壳体和核酸）结构简单（壳体和核酸）进入细胞才能进行复制进入细胞才能进行复制）应用：）应用：适合遗传操作，进行有关

49、生物大分子之间的相互作适合遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作用，基因表达调空肿瘤的发生和防治等研究。用，基因表达调空肿瘤的发生和防治等研究。作为外源基因的载体，用于蛋白质功能的研究以及作为外源基因的载体，用于蛋白质功能的研究以及肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗细胞生物学、细菌、细菌）特点：）特点：细菌培养方便，生长快，细菌培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变和分离、鉴定容易基因结构简单，突变株的诱变和分离、鉴定容易转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。）应用：）应用：转基因技术。转基因技术。基因的表达调控基因的表达调控细胞生物学、酵母、酵母）特点

50、）特点是单细胞生物是单细胞生物, ,可在基本培养基上生长可在基本培养基上生长, ,可通过改可通过改变物理或化学环境完全控制其生长变物理或化学环境完全控制其生长在单倍体和二倍体的状态下均可生长在单倍体和二倍体的状态下均可生长, ,并可在实验并可在实验条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换, ,这对这对其基因功能的研究十分有利其基因功能的研究十分有利有将近有将近31%31%编码蛋白质的基因或编码蛋白质的基因或ORFORF与哺乳动物编与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性码蛋白质的基因有高度的同源性细胞生物学）应用：）应用：细胞周期调控，细胞周期调控，P34P34cdc28 cdc28 突变，细胞停留在突变，细胞停留在G G1 1/S/S P34P34cdc2cdc2突变，细胞停留在突变，细胞停留在G G/S /S 利用酵母基因突变为基因表达调控，膜泡运输，细利用酵母基因突变为基因表达调控，膜泡运输，细胞分化，衰老等研究领域提供研究材料胞分化，衰老等研究领域提供研究材料细胞生物学、线虫、线虫）特点）特点: :通身透明通身透明, ,长不过长不过1mm1mm身体中所有细胞能被逐个盘点并各归其