现代食品发酵技术教案-柠檬酸

1、第四章 柠檬酸教研室：生物工程 教师姓名：陆步诗、余有贵课程名称现代食品发酵技术授课专业及班次07级食品质量与安全方向授课内容柠檬酸授课方式及学时讲授、2H目的要求熟悉柠檬酸发酵生产的一般流程和技术要点。重点与难点1、柠檬酸发酵生产的一般流程和技术要点2、生产技术要点的理解讲授内容及时间分配 4.1生产流程4.2原料预处理4.3菌种4.4 发酵4.5 提取4.6 浓缩、结晶与干燥参考资料1、王福源.现代食品发酵技术（第二版）中国轻工业出版社.20072、宋东安.调味品发酵工艺学.化学工业出版社,2009教学过程4.1生产流程4.2原料预处理薯干经粉碎，以1620的比例在调浆罐中加水调浆，pH自

2、然5.5；添加0.1中温型-淀粉酶，0.070MPa液化1015min；过滤除渣；通过(NH4)2S04计量罐控制并调节培养基中含氮量为0.20.4；连续灭菌后，泵入已灭菌的发酵罐中，装料量为发酵罐体积的8590。1 / 84.3菌种及其扩大培养1、菌种 采用薯干原料进行液体深层通气发酵的菌株主要有黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所选育)和黑曲霉T419(天津工业微生物研究所选育)，此二菌株具有糖化力高、产酸力强、发酵周期短、产物单一的特点，同时还具有营养要求低、耐高浓度柠檬酸、遗传性状稳定等优良性状，发酵6090h，产酸率可达1520，糖化率在97以上，已被大多数厂家采用。2、扩大培养根

3、据黑曲霉在实验室扩大培养阶段获得的是孢子还是菌丝体，其扩大培养分为孢子扩大培养和麸曲扩大培养2种方式。孢子扩大培养是利用液体或固体表面培养，收集黑曲霉孢子，再进行种子罐扩大培养或直接进行发酵盘液体浅层发酵生产柠檬酸；麸曲扩大培养是利用固体醅培养出黑曲霉菌丝体，再进行种子罐扩大培养或直接进行曲盘固体浅层发酵生产柠檬酸。目前，我国普遍采用麸曲扩大培养方式，其工艺流程如下：试管斜面固体菌种的表面培养250500mL茄子瓶固体表面培养10002000mL三角瓶麸曲固体表面培养种子罐液体菌种通气培养。 1)试管斜面固体菌种的表面培养 察氏琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基(10。Be/的无酒花麦汁，琼脂2)或

4、米曲汁琼脂培养基(1份米曲加4份水，55糖化34h，滤液用水调至10。Be/，用碱调pH6.O，加琼脂2)，加热溶化，分装试管，12130min灭菌后，摆放斜面，冷却后，以无菌操作接人已活化好的黑曲霉试管斜面菌种12白金耳或0.1mL孢子悬液，32培养45d，待长满茂盛的黑曲霉孢子即可使用。 2)250500mL茄子瓶固体表面培养 与试管斜面固体培养基相同，加热溶化，分装250500mL茄子瓶，每瓶45cm厚，12130min灭菌、冷却后，采用无菌操作，在试管斜面培养物中加入5mL无菌水，制成孢子悬液，将lmL孢子悬液接人茄子瓶固体培养基中，32培养67d，待长满茂盛的黑曲霉孢子即可使用。 3

5、)10002000ml三角瓶麸曲固体表面培养 按麸皮(过60目筛)：水=l：(1.O1.3)比例混合后分装10002000mL三角瓶，每瓶50lOOg，12130min灭菌、冷却后，采用无菌操作，在250500mL茄子瓶固体培养物中加入无菌水，制成孢子悬液，将孢子悬液接入10002000mL三角瓶固体培养基中，进行麸曲固体表面培养。3032培养1416h后，菌丝长满曲料表面，翻曲1次，疏松结块；继续培养1d，翻曲2次；再培养34d，待长满孢子，制成麸曲即可使用。 4)种子罐液体菌种通气培养 薯干经粉碎，以1620的比例在调浆罐中加水调浆，pH自然5.5；添加0.1中温型-淀粉酶，0.070MP

6、a液化1015min；过滤除渣；泵入O.15MPa 15min灭菌的种子罐中，装料量为种子罐的70；通过(NH4)2S04计量罐向种子罐中添加0.5(NH4)2S044，以提高糖化力；搅拌均匀后，实罐0.1MPa 30 min灭菌，冷却至35；在种子罐中接入黑曲霉孢子或麸曲，接种量为孢子数104cfumL；培养温度控制在35±1；罐压维持2050kPa；通风量根据培养阶段而定(以10m3为例)：O6h，孢子吸水膨胀，通风量保持910 m3h；610h，为孢子萌发期，通风量保持18 m3h；10h，为菌丝体生长繁殖期，通风量增至3672 m3h。种子培养1828h，当培养液的pH降至2

7、O2.5、滴定酸度为1.52.0mL100g，而且菌丝球直径为24um(不超过100um)，菌丝球数目达到(12)×104 cfumL时，种子培养结束。4.4 发酵待发酵罐中发酵培养基冷却至35时，利用无菌压缩空气将种子罐中的培养液泵人发酵罐，进行液体深层通气发酵。一般来说，发酵前期(018h)为菌丝生长和淀粉糖化阶段(当产酸量与还原糖的总量接近起始可发酵糖总量时，糖化阶段完成)；发酵中后期(1890h)为柠檬酸合成与积累阶段。 1)接种量的控制 在一定范围内，孢子接种量与产酸速率成正比。从理论上讲，菌球体的极限数量与接种孢子数量相等。由于孢子相互吸附以及孢子在发酵液中萌发时菌丝互相

8、缠绕等物理作用，大多数菌丝球是由几个孢子、乃至一团孢子形成的。孢子接种量越大，菌丝球直径越小、越多，产酸率越高。一般接种量为孢子数10×104 cfumL。 2)发酵温度的控制 在黑曲霉液体深层发酵中，温度低于28，导致长菌和产酸缓慢；高于37，导致杂酸形成过量。一般来说，发酵前期(018h)，温度控制在3638，甚至可采用40高温培养，促进菌丝生长和淀粉糖化；发酵中后期(1890h)，温度降为35±1。 (3)发酵液pH值的控制 发酵前期(018h)，发酵液pH值控制在4.O4.5，促使淀粉糖化；发酵中后期(1890h)，发酵液pH值降至2.5左右，有利于柠檬酸的合成与积

9、累。研究表明，在黑曲霉液体深层发酵中后期(1890h)的产酸阶段，如果发酵液pH值在3.0以上，容易产生草酸；如果发酵液pH值升至5.0以上，则容易生成葡萄糖酸。另外，为防止发酵中后期(1890h)pH值下降过快而导致菌体早衰，一般在发酵2448h后，在发酵液中添加(510)gL的碳酸钙，以维持发酵产酸阶段正常的pH值水平。 (4)通风供氧和搅拌的控制 柠檬酸发酵是典型好氧发酵，对氧十分敏感。黑曲霉生长期溶氧分压不得低于1.8kPa，产酸期溶氧分压不得低于3.2kPa。当发酵进入产酸期时，在一定范围内，产酸速率几乎与溶氧分压成正比，溶氧分压下降到10kPa时，产酸速率下降不大；溶氧分压下降到3

10、.2kPa时，产酸能力基本丧失；溶氧分压下降到1.8kPa(临界溶氧分压)以下时，产酸能力完全丧失，而且低溶氧下产酸能力的丧失，很少能重新恢复。通过通风量的控制，使产酸速率保持在(23)g(h.L)的水平，如果产酸速率过快，则造成菌体早衰，柠檬酸的最终产量下降。对于50m3发酵罐而言，发酵前期(018h)，通风量控制在O080.1vvm；发酵中后期(1890h)，通风量控制在0.12O.15vvm。50m3箭叶涡轮搅拌桨式发酵罐的搅拌速率控制在90110rmin，100m3自吸式桨叶低搅拌式发酵罐的搅拌速率控制在135rmin。整个发酵期间罐压保持O.1MPa。 (5)发酵终点控制 以薯干粉为

11、原料，黑曲霉液体深层通气发酵至6090h，当发酵液中总糖含量自140160gL降至残糖含量为2gL以下、产生的柠檬酸浓度达到120155gL、糖的转化率达到9397时，可升温终止发酵，泵送至贮罐中，及时进行提取。4.5 提取柠檬酸提取的方法有钙盐法、萃取法、离子交换法、电渗析法等。但目前国内大多采用钙盐一离子交换法，其工艺流程为：发酵醪的预处理过滤中和沉淀酸解净化脱色。 1)发酵醪的预处理 新鲜成熟发酵醪升温至7590，温度不宜过高，加热时间不宜过长。其原理是杀死柠檬酸生产菌和杂菌，终止发酵，并防止柠檬酸被代谢分解；使蛋白质变性，絮凝和破坏胶体，降低料液黏度，利于过滤；使菌体中的柠檬酸部分释放

12、。加热温度过高或时间过长，会使菌体破裂自溶，释放出蛋白质，使料液黏度增加、颜色变褐，不利于净化。 2)过滤 过滤目的是去除发酵醪中的悬浮物、草酸，尽可能减少滤液的稀释度，把柠檬酸的损失减少到最低限度。其原理是用一种多毛细孔的过滤介质，利用过滤介质两侧的压力差为推动力，使柠檬酸发酵醪的液体通过小孔，得到澄清的滤液，而菌体、纤维等残渣悬浮物被截留、积累在介质表面形成滤饼。过滤效果取决于滤饼的厚度和特性，滤饼达到一定厚度时，才变成真正的过滤介质，为此，开始过滤时流速不宜过大，否则细小颗粒宜穿过介质空隙而未被截留，只有当介质表面积有滤饼时，滤液才变清；由于草酸钙溶解度低于硫酸钙，在一次滤液中加硫酸钙，

13、使生成草酸钙，在复滤时再一并除去。 过滤液质量主要参数：一次滤液柠檬酸(一水)9.Og100mL，悬浮物O.1g100mL；滤饼含水量5570，柠檬酸(一水)2.5；复滤液柠檬酸(一水)9.0g100mL，悬浮液5mgL，草酸为0。 3)中和沉淀 过滤获得了去除菌体、残渣和草酸的澄清柠檬酸液，其中除主要含有柠檬酸外，还含有可溶于水的碳水化合物、胶体、有机杂酸、蛋白质等杂质。 根据在一定温度和pH条件下柠檬酸钙在水中的溶解度极小的特性，采用钙盐或钙碱与溶液中的柠檬酸发生中和反应，生成四水柠檬酸钙Ca3(C6H5O7)2.4H2O从溶液中沉淀析出，除去残液后，用8090热水洗涤四水柠檬酸钙沉淀，可

14、最大限度地将可溶性杂质与柠檬酸钙分离，其反应式为： 2 C6H8O7. H2O +3 CaC03 = Ca3(C6H5O7)2.4H2O +3CO2+H20 2 C6H8O7. H2O +3Ca(OH)2 = Ca3(C6H5O7)2.4H2O +H20 中和技术参数: 每千克柠檬酸加石膏量O.03O.15kg，中和剂(CaC03.CaO)浆乳中固型物含量22，中和剂含MgO1.5，盐酸不溶物1.01，Fe203+A12031.0。 中和起始温度7075，中和最终温度8590。 中和最终pH4.44.6(CaC03)、4.85.2Ca(OH)2。 洗涤柠檬酸钙水温8590，洗水量(与钙比)：采

15、用带式过滤机为3.O3.5倍；采用抽滤为4.55.0倍。 过滤真空度O.0250.028MPa。 柠檬酸钙和废水的质量要求：柠檬酸钙含固型物40，易碳化合物(Readily Carbonizable substances，RCS)0.02(以糖计)，废水中柠檬酸钙含量300mgL。 4)酸解 利用柠檬酸钙在酸性条件下，其解离常数随H+浓度的增高而增大的特性，在强酸(硫酸)存在的溶液中产生复分解反应，生成难溶于水的石膏(CaS04)沉淀，而将弱酸(柠檬酸)游离出来。工业生产中，控制酸解温度为6070下，CaS04.2H20的溶解度低于Ca3(C6H5O7)2.4H2O的溶解度的原理，加H2S04

16、产生复分解反应，将柠檬酸从柠檬酸钙中分离出来，然后过滤除去硫酸钙(石膏)，获得粗柠檬酸液(酸解液)。其反应如下： Ca3(C6H5O7)2.4H2O+3 H2S04+4H20= 2 C6H8O7. H2O +3 CaS04.2H20 酸解技术参数 酸解用的H2S04纯度93，铁含量O.01，砷含量O.005；酸解开始温度6070，洗水温度7080；洗水用量(与湿柠檬酸钙比)约1.5倍；过滤真空度0.0250.03MPa. 酸解液和废弃石膏的质量要求 酸解液含柠檬酸(一水)22g100mL，SO42-4.5g100mL，C1-100mgL，石膏颗粒lOmgL，易碳化物(以糖计)0.012glOO

17、mL；废石膏含水4.5，柠檬酸(一水)0.5，柠檬酸钙0.2。 5)净化脱色 粗柠檬酸溶液中残留的色素、蛋白质等可溶性的大分子化合物，其分子质量为103106Da，分子大小在1100nm，属胶体物质范畴，它们大多是两性电解质；此外还含有有害的Ca2+、K+、Mg2+、Fe3+、SO42-、C1-等离子。净化是指通过活性炭和阳、阴离子交换树脂处理，除去粗柠檬酸酸解液中的色素和离子，使粗柠檬酸液得到提纯和精制，获得净化精柠檬酸液。4.6 浓缩、结晶与干燥（1)浓缩 净化了的精柠檬酸液浓度一般柠檬酸(一水)含量为18g100mL以上，要使其达到7582g100mL的结晶浓度，必须通过蒸发除去溶剂，温

18、度过高柠檬酸会分解，并易产生色素。因此，一般采用60、14kPa条件下进行减压蒸发浓缩。为了充分利用蒸发过程中产生的二次蒸汽，降低能耗，工业生产常采用二段或三段蒸发。 （2)结晶 当柠檬酸净化液蒸发浓缩至过饱和状态处于介稳区时，可通过刺激结晶(如加入晶种或自然起晶的方法)，使其溶液浓度达临界浓度，溶液中就可产生微细的晶粒，当过饱和度达到一定程度时，溶质分子之间的引力使溶质质点彼此靠近，碰撞机会增多，使它有规则地聚集排列在晶核上，逐渐长成一定大小和形状的晶体。 一水柠檬酸结晶 浓缩温度55时柠檬酸的饱和浓度为73%，当继续蒸发浓缩至81 %即为过饱和状态时，将它立即移入结晶缸中，装至7085液位，启动搅拌器，用冷水缓慢降温至临界温度36.6时开始结晶，小心控制降温速度，刺激起晶或添加晶种，从36开始逐渐降温直至料温降到10以下结晶结束，及时用离心机分离出晶体和母液，并用少量无离子冷水洗晶体表面吸着的母液，湿晶体送干燥工序处理。 无水柠檬酸结晶 由于无水柠檬酸结晶的临界温度是在36.6以上，因此它的体系过饱和温度要高，结晶温度要控制在40以上，当浓缩温度为60时，饱和