蛋白质及氨基酸分析

1、3.5 蛋白质及氨基酸分析蛋白质及氨基酸分析一、 概述 蛋白质是一类存在于所有细胞中含量丰富的成分，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。 食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多已经被纯化和定性。蛋白质分子质量的变化范围通常为50001000000u，它们包括氢、碳、氮、氧和硫等元素，20种常见-氨基酸是蛋白质的主要构成。 蛋白质可以按照它的成分、结构、生物功能或者溶解特性来分类。如水解简单蛋白质只得到氨基酸，但结合类蛋白质还含有非氨基酸成分。 蛋白质有非常独特的构型，它可被各种变性因素，如热、酸、碱、8molL尿素、6mol/L盐酸胍、有机溶剂和去垢剂所改变，其溶解

2、性及功能性也可被变性剂所改变。 1.蛋白质分析的重要性蛋白质分析的重要性 (1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。 (2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。 (3)营养标签 总蛋白质含量； 氨基酸组成； 混合物中的特定蛋白质的含量； 蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量； 非蛋白氮； 蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或 氮平衡)。 2.食

3、品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量 在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 3.蛋白质水解 4.蛋白质测定方法蛋白质测定方法

4、测定蛋白质的方法可分为两大类： 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。 二、蛋白质的含量测定- 凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法 (1) 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标

5、准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 蒸馏蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：a：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下： (2)(2)适用

6、范围适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 (3)(3)仪器仪器:500ml凯氏烧瓶；定氮蒸馏装置 (4)(4)试剂试剂:硫酸铜； 硫酸钾； 硫酸； 40gL硼酸溶液； 混合指示剂； 400gL氢氧化钠；0.1molL盐酸标准溶液 (5) 操作步骤： 样品消化：样品消化：准确称取均匀的固体样品0.53g,或半固体样品25g,或吸取溶液样品1525ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接

7、，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。 滴定滴定：将接受瓶内的硼酸液用将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。相同）。 (6) 结果计算结果计算三、蛋白质的快速测定法三、蛋白质的快速测定法-双缩脲法双缩脲法 1.原理：脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2加热至加热至150160时，两分子缩和成双缩脲。时，两分子缩和成双缩脲。 双缩脲能

8、和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲络和物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）反应） 蛋白质分子中含有肽键（蛋白质分子中含有肽键（ CONH），），与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（吸光度，确定含量。（560nm） 2.方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、

9、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器：分光光度计，离心机（4000 r/min） 4.试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 甘油作为稳定剂：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时慢慢加入50ml4%CuSO4。 酒石酸钠作稳定剂：吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。 (2) 四氯化碳 5.操作方法：标准曲线绘制 准确称0.6g样品使用试剂 准确称0.5g样品使用试剂 假如用试剂

10、（1）标准曲线绘制 按凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品为标样，根据样品中蛋白质含量，取离心澄清液0.0，2.0，4.0，8.0，10.0ml于10ml容量瓶中分别加水定容，在560nm波长下测定其吸光度。 以蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （2）准确称样0.5g于80ml离心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸钾钠稳定剂盖上盖子离心10min（4000转/分）放置1小时吸混合液15ml于20ml离心管中离心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。 6 计算： 蛋白质%=（C/W）100 C-从标准曲线上查得得

11、蛋白质含（mg） W-测定样液时相当于样品重量（mg） 7.双缩脲法优点 该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法； 比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离； 几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应； 不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。 8.缺点 不如福林酚法灵敏，分析时至少需要24mg蛋白质； 如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加； 高浓度的胺盐会干扰反应； 不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色； 如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色； 此方法不是一个测量绝对值的方法，必须

12、用已知浓度的蛋白质(如BSA)或经凯氏定氮法校正。其他测定方法 考马斯亮蓝G250染色比色法（Bradford法) 福林-酚比色法（洛里法）四、氨基酸总量测定氨基酸总量测定 随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。 氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多

13、种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。 （一）双指示剂甲醛滴定法（一）双指示剂甲醛滴定法 1. 原理：氨基酸本身有碱性 NH2 基，又有酸性 COOH 基，它们相互作用而生成中性内盐，加入甲醛溶液后，与 NH2 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 COOH 基。 2特点：此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情

14、况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。（适于食品中游离氨基酸的测定） 3双指示剂： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性红50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4操作： 取相同两份样品2030mg分别于250ml三角瓶各加50ml蒸馏水一份加中性红3滴用0.1mol/L NaOH滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml摇匀用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。 5.计算： 氨基酸态氮

15、= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积 V2用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol。 （二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法 1. 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。（生成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm） 2. 试剂：试剂： （1）磷酸缓冲液（）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：）制备方法如下： 称磷酸二氢钾称磷酸二氢钾4.5350g。溶解定容至。溶解定容至500ml 称称NaH2PO412H2O 11.93

16、80g，溶解定容至，溶解定容至500ml 取上述配好的磷酸二氢钾取上述配好的磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠与磷酸氢二钠190ml混合即为混合即为pH8.04的缓冲液。的缓冲液。 （2）2%茚三酮溶液： 称茚三酮1g溶于35ml热水加入40mg氯化亚锡（SnCl2H2O）搅拌过滤（作防腐剂）于冷暗处过夜定容50ml （3）氨基酸标液 称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml摇匀吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200g/ml标液 3 操作方法： （1）绘制标准曲线： 取7个25ml容量瓶，吸取标液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于7个25

17、ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。 （2）样品测定： 取样品5.0010.0g（液体样5-10ml）于烧杯中加50ml水和活性碳约5g加热过滤用3040ml热水洗涤活性炭吸澄清样液14ml加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。 4 4 计算计算 氨基酸含量（毫克氨基酸含量（毫克/100/100克）克）=C=C100/100/（m m10001000） C C从标准曲线上查得得氨基酸的量从标准曲线上查

18、得得氨基酸的量（g g） m m 测定得样品溶液相当于样品的量测定得样品溶液相当于样品的量（g g） 5 注意事项注意事项 茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取纯化，方法如下：取10g10g茚三酮容于茚三酮容于40ml40ml热热水中，加一克活性炭，摇匀静置水中，加一克活性炭，摇匀静置3030分钟，分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用色结晶，过滤，用2ml2ml冷水洗涤结晶，置干冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。燥皿中干燥，装瓶备用。 （三）氨基酸自动分析仪 样品处理：称取试样0.2 g 于10 mL具塞试管中，加入6 mol / L盐酸10 mL，氮吹仪吹氮气15分钟后，试管塞处垫以可拉伸生物薄膜后旋紧塞子，封管，110 烘箱水解24 h。水解后冷却至室温，将水解液过滤到50 mL小容量瓶中，水解管用去离子水洗涤三次，洗涤液过滤到容