流式细胞仪操作规程-SOP

1、 流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任：

2、检验科 实验室： 淋巴细胞亚群测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同

3、的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD45/4/8/3 No.660701

4、3 CD45/56/19/3 No.6607073 CD4/8/3 No.IM1650 同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液

5、(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进

6、行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机) 报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03临

7、床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用ThTs比值来判断病人的免疫状况。ThTs比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿

8、瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol）1.选参数点击点击4色3色点击（命名，点击save） 2.画图 结果 此图为CD45圈门如果做绝对计数，则填写Flow-Count的浓度选中cell/ul即可活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞

9、仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规

10、格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646 CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834 CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ） 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.854

11、6930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测

12、定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值(百分数) CD3+/HLA-DR+ 3.1±1.3% CD3+/CD25+ 15.9±3.7% CD3+/CD45RO+ 3.3±1.55% CD3+/CD45RA+/CD4+ 20.51±3.64% 临床意义1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。如活化状态的监测是对机体移植免疫状

13、况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+ >5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感

14、染疾病中减少。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（Result）HLA-B27测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

15、 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 (HLA-B27/HLA-B7 No.IM1502 同型对照IgG1IgG2a No.IM1389) 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光

16、微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择

17、35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果 报告阴阳性操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值 阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上，阳性率>90%。 临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其

18、是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。方案（Protocol）1.选参数点击点击 键入文件名，点击Save2.画图 结果1. positive (+) X-Mean=17.12. negative(-) X-Mean=

19、1.2 X-Mean=5.8CD55/CD59测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能

20、用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 (CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE No.IM2726) 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS

21、 XL/FC500/Altra 样本制备:(一)白细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4洗涤离心 5上机测样(二)红细胞CD55CD59检测 1准备2支流式细胞仪专用管

22、，分别标记 2分别加入CD55CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。 4洗涤离心。5混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值 CD55>97% CD59>97% PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒细胞CD59>84% 临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（P

23、rotocol）(同HLA-B27) 结果1.RBC: normal 2.RBC: abnormal 3.WBC干细胞检测和绝对计数方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样

24、本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C N

25、o.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择

26、35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机)6)上机测样报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值(百分数（绝对值）) CD34+/CD45+ 0.58±0.29% 临床意义目前把CD34作为造血干细胞的主要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干细胞水平定量的检测方法。方案（Protocol）同

27、淋巴细胞亚群检测结果（Result） 白血病免疫分型测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜上或膜内相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 骨髓采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释

28、，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.854693

29、0) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-样本制备： 细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备

30、系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分

31、钟。 7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值 CD34+<5% MPO+<5% 粒系<20% 淋系<30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（Protocol）T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4检测方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomyc

32、in和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-和IL-4进行测定。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不

33、能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 淋巴细胞培养体系(自配) 成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。 单克隆抗体 ( BeckmanCoulter公司) CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-FITC(No.IM2716)。 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持

34、稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 细胞培养与染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C02 37孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同

35、时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表达。 淋巴细胞在FSSSC散点图中位置，即A门内细胞； A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布： 1区数值-Th 1细胞 (%) 4区数值-Th 2细胞 (%) 2区数值-Th 0细胞 (%)报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 正常参考值 Thl(IFN-)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50&

36、#177;0.44% ThO ：0.51±0.26% 临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2细胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺

37、激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。方案（Protocol） 细胞周期分析方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量标本采集与处理 检测对象 实体（肿瘤）组织、灌洗液、石蜡块、培养细胞 要求 1实体（肿瘤）组织、灌洗液和培养细胞如果不能立即做应用冷乙醇固定，20可保存23个

38、月，70可保存半年以上。 2样本计数应在1.0×106/ml 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：DNA-Prep试剂系统 液体 28 （No.6607055） （包括DNA-Prep LPR和 DNA-Prep 染料） 2：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 3：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 4：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 灌洗液或培养细胞1 PBS洗，稀释为1.0×106/ml，

39、取100ul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室温避光15分钟。2 过300目滤网，上机检测。实体（肿瘤）组织1 单细胞悬液制备：将固定或新鲜的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。（如果是淋巴瘤只需用生理盐水冲即可）。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以500800转离心沉淀2分钟。2 染色：同上3 上机检测石蜡块1 脱蜡水化：石蜡块切成50um厚，35片，放入二甲苯中室温放置24小时，更换二甲苯室温再置24小时。取出加无水乙醇10分

40、钟，依次加95乙醇、70乙醇、50乙醇及双蒸水各10分钟。2 单细胞悬液制备及染色：同上3 上机检测报告结果 报告各期的百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值 临床意义DNA倍体分析用于肿瘤早期诊断、良恶性肿瘤判断、肿瘤预后、治疗方案的选择，正常组织和良性肿瘤DNA均为二倍体，恶性肿瘤时则出现异倍体。方案（Protocol）1.选参数 选择Cytometer Control点击Parameters后2.画图 结果（Result）血小板膜表面抗体测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 间接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富

41、集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量2ml。 2样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。 4溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：一抗 冻

42、干 0.2mg -20小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285) 二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)冻干 1mg -20 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCo

43、ulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3) 分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。4) 分别向已编好号的试管中依次加入一抗和二抗（设对照）5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟6)洗或不洗，上机测样全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）6）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 参考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。方案（Protocol） 红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FIT