无梗五加果色素提取及纯化工艺研究

1、编号编号(学号学号)：08494094毕毕 业业 论论 文文 ( 2008 届本科届本科)题题 目：目： 无梗五加果色素提取及纯化工艺研究无梗五加果色素提取及纯化工艺研究 学学 院：院： 食食 品品 学学 院院 专专 业：业： 食品科学与工程食品科学与工程 姓姓 名：名： 韩韩 颖颖 指导教师：指导教师： 冯颖冯颖 讲师讲师 完成日期：完成日期： 2008 年年 6 月月 10 日日毕业论文任务书毕业论文任务书论文题目论文题目无梗五加果色素提取及纯化工艺研究下发任下发任务日期务日期2007 年 9 月学生姓名学生姓名韩 颖指导教师指导教师冯颖 讲师一、论文主要内容一、论文主要内容1通过单因素试

2、验，确定无梗五加果色素的提取剂种类，并对浸提温度、提取剂用量及浸提时间进行筛选，并在此基础上，进行正交试验，确定色素浸提的最佳工艺。2通过试验筛选出纯化无梗五加果色素的最佳树脂，然后确定 HPD600对无梗五加果色素的最佳纯化工艺条件。3通过花色苷类化合物的显色反应，初步确定无梗五加果色素的组分。二、论文的基本要求二、论文的基本要求1. 掌握无梗五加果色素的提取工艺；2. 了解并掌握大孔树脂的吸附原理，及影响吸附和解吸的条件；3. 通过毕业论文工作，学习并掌握研究方案的制定、实施、总结和论文报告写作等基本原理和方法。三三.论文工作进度安排论文工作进度安排阶段阶段论文各阶段名称论文各阶段名称日期

3、日期1布置任务2007 年 9 月2查阅资料，设计实验方案2007 年 10 月3进行实验预备，确定具体的实验方案2007 年 11 月4正式实验，并进行数据的归纳整理2008 年 3 月5论文成稿、预答辩2008 年 6 月6毕业论文答辩2008 年 6 月备注：备注：四四.收集的资料及主要参考文献收集的资料及主要参考文献(指导教师指定指导教师指定)1 淳于家龙,郭丽娜,张长顺.无梗五加化学成分与药理活性的研究进展J.中国药业2002,11(12):73-74.2 庞志申.花色苷研究概况.北京农业科学.2000,18(5):3742.3 袁海波,童华荣.天然食用色素花青素应用研究进展,广州食

4、品工业科技,17(3): 7577.4 杨虎清,黄素娟.食品色素的过去、现在和未来中国食品添加剂.2002 (3)：1014.5 钟瑞敏,葡萄花色苷优化提取和纯化工艺研究.韶关大学学报1995,12(8):113121.6 夏明,杜琪珍.高速逆流色谱提取分离红曲色素的研究.广州食品工业科技,2002,18(4):15-17.7 孙振方,高凤兰,杜秀华.无梗五加片治疗白细胞减少症临床观察J中国中医药科技,1997,4(2):10.8 李兴运,张盛桥,李晓珍.无梗五加冲剂治疗妇女更年期综合症双盲试验研究J.中药药理与临床,1989,5(1):45.9 周重楚,王桂芝,宋晓凯.无梗五加醇提物的抗变态

5、性反应性炎症作用J.中药通报,1985,10(10):3739.10 任晓枫,高凤兰，孙振方.无梗五加药效学研究J.中国中医药科技,1998,5(1):4041.11 陈阳，王军华，滕利荣 大孔树脂法纯化红花芸豆色素及初步鉴定J农业工程学报,2007,6(6):238.说明：此任务由指导教师填写一式两份，一份发给学生，一份发给指导教师留存。说明：此任务由指导教师填写一式两份，一份发给学生，一份发给指导教师留存。沈阳农业大学毕业论文选题审批表沈阳农业大学毕业论文选题审批表选题名称无梗五加果色素提取及纯化工艺研究题目来源自 选学号08494094姓名韩颖专业食品科学与工程指导教师冯颖职称讲师研 究

6、内 容1. 通过单因素试验，确定无梗五加果色素的提取剂种类，并对浸提温度、提取剂用量及浸提时间进行筛选，确定色素浸提的最佳工艺。2. 通过试验筛选出纯化无梗五加果色素的最佳树脂，然后确定 HPD600 对无梗五加果色素的最佳纯化工艺条件。研 究计 划2008 年 3 月：通过试验确定无梗五加果色素的提取剂种类，浸提温度、提取剂用量及浸提时间。2008 年 4 月：通过试验筛选出纯化无梗五加果色素的最佳树脂及最佳纯化工艺条件。2008 年 6 月：论文成稿。特 色1. 无梗五加当作刺五加药用，具有许多药理学作用。2. 目前人们对五加根，茎、叶的研究十分多，但对五加果的研究却很少。指 导 教 师

7、意 见教 研 室 意 见学 院 意 见毕业论文指导记录毕业论文指导记录学生姓名韩颖专业食品科学与工程指导教师姓名冯颖职称讲师本年度指导毕业生人数6论文题目无梗五加果色素提取及纯化工艺研究时间地点指导内容指 导 过 程学生签字：年 月 日 指导教师签字：年 月 日教研室主任签字：年 月 日沈阳农业大学毕业论文考核表沈阳农业大学毕业论文考核表论文题目：无梗五加果色素提取及纯化工艺研究论文题目：无梗五加果色素提取及纯化工艺研究姓名：韩颖姓名：韩颖 学号：学号：08494094 专业：食品科学与工程专业：食品科学与工程指导教师评语：指导教师评语： 指导教师指导教师(签字签字)： 年年 月月 日日评阅人

8、评审意见：评阅人评审意见： 评阅人评阅人(签字签字)： 年年 月月 日日答辩委员会意见：答辩委员会意见： 主任委员主任委员(签字签字)： 年年 月月 日日注：答辩委员会意见除填写简要评语、给出成绩外，还要提出是否授予学位的建议注：答辩委员会意见除填写简要评语、给出成绩外，还要提出是否授予学位的建议成绩：目录目录中文摘要(关键词).1外文摘要(关键词).21 前 言 .31.1 花色苷的研究概况 .31.2 花色苷类天然植物色素的纯化方法.51.2.1 离子交换树脂柱层析 .51.2.2 大孔树脂分离 .51.2.3 其他纯化方法 .61.3 无梗五加的研究概况.61.4 本文研究内容及目标.7

9、2 材料和方法 .92.1 试验材料 .92.2 试验试剂 .92.3 试验方法 .92.3.1 无梗五加果色素提取条件的研究 .92.3.2 最佳树脂的选择 .92.3.3 静态试验 .92.3.3.1 PH 对树脂吸附性能的影响.92.3.3.2 洗脱剂(乙醇)浓度对树脂吸附性能的影响.102.3.3.3 洗脱剂的PH 对解吸的影响.102.3.4 动态试验 .102.3.4.1 上样液与装柱量比例的确定 .102.3.4.2 洗脱剂用量的确定 .102.3.5 化学显色法鉴定无梗五加果色素 .103 结果与分析 .103.1 无梗五加果色素提取条件的研究结果.103.1.1 提取剂种类的

10、选择.103.1.2 提取剂PH 的筛选.113.1.3 浸提温度对色素提取效果的影响.113.1.4 提取剂用量对色素提取效果的影响.123.1.5 浸提时间对色素提取效果的影响.123.1.6 正交试验确定无梗五加果色素提取的最佳条件.123.2 最佳树脂的确定 .133.3 静态试验 .143.3.1 PH 对 HPD600 树脂吸附性能的影响.143.3.2 洗脱剂(乙醇)浓度对树脂吸附性能的影响.143.3.3 洗脱剂的PH 对解吸的影响.153.4 动态试验 .163.4.1 上样液与装柱量的比例确定 .163.4.2 洗脱剂用量的确定 .163. 5 化学显色法定性鉴定无梗五加果

11、色素.174 结论.184.1 无梗五加果色素的提取条件.184.2 无梗五加果色素的纯化条件.184.3 无梗五加果色素组分的初步分析.185 讨论.185.1 影响大孔吸附树脂纯化植物化学成分的因素.18参考文献.20致谢.21沈阳农业大学学士学位论文1摘要摘要刺五加具有人参样作用，能调节中枢神经系统、增强机体免疫能力、抗疲劳、抗衰老，亦对内分泌系统及造血系统有显著的药理活性。长期以来，在东北地区，将无梗五加当作刺五加药用，未见不良反应报道。为扩大药用资源，无梗五加已引起国内外学者的浓厚兴趣1。目前人们对五加根，茎，叶的研究十分多，但对五加果的研究却很少，所以为了资源利用提供依据，寻找一种

12、安全可行且利用率高的天然色素作为食品添加剂 ，本实验采用浸提法提取无梗五加果色素，采用大孔树脂法来对无梗五加色素进行纯化，并对其色素组分进行初步分析。结果表明无梗五加果色素浸提的最佳工艺条件为：50%的乙醇溶液50mL；pH值为3；20作为浸提温度；浸提时间以90min为佳。HPD600型大孔树脂对pH值为3的无梗五加果色素浸提液吸附率为79.178%，pH值1.5的60%乙醇可较好的洗脱色素。纯化后的色素初步被鉴定为花色苷类。关键词：关键词：无梗五加；大孔树脂；花色苷；提取无梗五加果色素提取及纯化工艺研究2AbstractAcanthopanax senticosus has the rol

13、e of ginseng, which can adjust the central nervous system, enhance the ability of the immune, which is also anti-fatigue and anti-aging. It also on the endocrine system and the hematopoietic system has significant pharmacological activity. For a long time, in the northeast region, Acanthopanax sessi

14、liflorus were used as medical Acanthopanax senticosus. No adverse reactions were reported. For the expansion of medicinal resources, scholars at home and abroad have attracted great interest in Acanthopanax sessiliflorus1.Currently the roots, stems and leaves of Acanthopanax sessiliflorus were resea

15、rched more, but the fruit of Acanthopanax sessiliflorus was little. In order to provide the basis for the use of resources , find a safe and feasible and high utilization of the natural pigment as a food additive.This study use Extraction method from Acanthopanax sessiliflorus，and a method of macrop

16、orous resin to purify the pigment of Acanthopanax sessiliflorus and conducted a preliminary analysis of pigment components.Results show that the optimum conditions to extract Acanthopanax sessiliflorus are as follows:50 percent of the ethanol 50 mL; pH value of 3;20 as the temperature extraction;90

17、min time to extract better. Macroporous resin HPD600 is favorable in purification of the Acanthopanax sessiliflorus pigments: adsorption rate of pigments (solvent pH 3) to HPD600 resin is79.178%. 60% ethanol (pH1.5) is suitable for elution. And, the main components of the purified pigments are prima

18、rily identified as anthocyanin.Key words：Acanthopanax sessiliflorus；Macroporous resins；Anthocyanin；Extraction沈阳农业大学学士学位论文31 前言前言1.1 花色苷的研究概况花色苷的研究概况花色苷是最常见的天然色素之一，是我们日常饮食中不可缺少的组成部分。因为它们在自然界中分布广泛，构成了植物王国中绝大多数品种的蓝色、红色、紫色和黄色等，是人们最熟悉的水溶性天然食用色素。最初使用花色苷名称的人是Marguart(1835)，最早获得花色苷结构的是Molish(1905)，花色素类最初是由L

19、. C. Marguart (1835)在处理矢车菊的蓝色花时所命的名(希腊语antbos花+cyanos青)。此后，许多人致力于这方面的研究，其中贡献最大的要算是Harbone等人。他得出了各类花色苷的纸层析的经典数据，并奠定了花色苷的鉴定中颜色反应和光谱特性的实验基础。此外，美国的Wrollod、日本的安田齐、台湾的蔡正宗等也长年从事这一领域的研究，并形成许多宝贵的资料。花色苷是由花色苷配基(苷元)与糖键合形成的一种多酚类物质。现已查明，天然花色苷配基的基本结构为3, 5, 7三羟基2苯基苯并吡喃，是黄烊盐离子上不同位置被不同数目的游离羟基或甲氧基取代而形成的。如图1所示：图图1 2苯基苯

20、并吡喃阳离子苯基苯并吡喃阳离子到目前为止，总共有17种已知的天然花色素或糖苷配基。每种花色素常根据最先分离得到它们的植物的名称来命名。在高等植物中，有6种花色素比较普遍2(如表1所示)。无梗五加果色素提取及纯化工艺研究4表表1 6种主要花色素种主要花色素结构编号英文简称英文全称中文名称R1R2主要来源颜色1PgPelargonidin天竺葵色素HH草莓、萝卜皮深红2PnPeonidin芍药色素OCH3H芒果、樱桃蓝红3CyCyanidin矢车菊素/花青素OHH桑椹、苹果皮蓝红4MvMalvidin锦葵色素OCH3OCH3葡萄皮紫5PtPetunidin矮牵牛色素/碧冬茄素OHOCH3葡萄皮紫蓝

21、6DpDelpHinidin飞燕草素/花翠素/翠雀素OHOH石榴、茄子紫蓝花色苷颜色受介质pH值影响较大，随pH值变化而改变，其原因是花色苷结构中吡喃杂环上的氧原子为四价，使得表现出某些碱性性质，而本身又含有酚羟基又具有某些酸的性质，因此在酸、碱作用下，花色苷化学结构发生变化。近20多年来，花色苷的抗氧化作用开始引起人们的注目，其在生物体内的各种功能研究逐渐成为热门焦点。由于色素的出色功能，目前还专门出现一门称为“色素营养学”学科，主要研究植物色素(Phytopigments)的营养生理功能，此为花色苷的开发以及利用发挥了积极作用。根据医食同源/药食同源的原则，通过摄入一定量的植物色素，在生物

22、体内起到一定调节生理功能作用，此正是人们所期待的。由WHO/FAO组成的食品添加剂联合专家委员会(IECFA)考查了花色苷的毒理学资料，结论是“毒性很低”。唯一的负面作用是使一些动物器官(肝、肾上腺、甲状腺)的重量和体重下降。1982年确定其人体ADI值(每日允许摄入剂量)为02.5mg/kg体重。花色苷广泛存在于开花植物(被子植物)中，据初步统计，27个科、73个属植物中含花色苷3。现在，天然色素的开发与应用发展很快，不少天然色素是综合利用的产物。如从红葡萄酒厂的废渣中提取红葡萄色素，从高粱壳中提取高粱红色素，从黑米中提取黑米红。葡萄皮是花色苷类色素的主要原料。这些商业用色素在食品中用量0.

23、5%5%，也用于化妆品，如红色花色苷做口红。据估计，目前全世界每年有9.4亿美元的食品色素市场贸易额，其中天然色素及天然来源色素合计4.39亿美元，接近总贸易额的一半。随着消费者对纯天然食品的兴趣日沈阳农业大学学士学位论文5益增加，天然色素的市场份额迅速增加。据预测，未来几年天然色素每年将以5%10%的速度增加。当前，国外的食品着色剂大多以天然色素为主，合成色素为辅；而国内的天然食用色素研究起步较晚，目前尚处于天然色素与合成色素并存的状况。但我国已把开发天然食用色素作为发展食品添加剂的一个重要方向，天然色素开发也较快：近十年来，我国批准使用的天然着色剂从20多种增加到40多种，是目前世界上批准

24、天然着色剂最多的国家。1990年我国合成色素的产量约为800吨，而食用天然色素的产量约达10000吨4(其中焦糖色素7000吨)：目前在中国生产食用天然色素的工厂百余家，1998年产量已达25000吨。2003年全国着色剂约为6.65万吨，其中合成色素约2400吨，其余皆为天然色素。而仅国家“七五”重点科技攻关项目就开发了4种天然食用色素新产品。可以肯定，凭借丰富的天然资源和国家政策支持，我国的天然食用色素研究今后必将迅速发展。1.2 花色苷类天然植物色素的纯化方法花色苷类天然植物色素的纯化方法1.2.1 离子交换树脂柱层析离子交换树脂柱层析离子交换树脂柱层析(ion exchange chr

25、omatography，简称IEC)是从复杂的混合物中，分离性质相似的大分子的一种方法。自1935年Adams和Holmes成功地研制了酚醛型离子交换树脂以来，离子交换树脂的应用已经历了60多年的发展历史。各种类型离子交换树脂的相继出现，应用技术的不断改善，应用范围的日益扩大，都显示了离子交换树脂所具备的优越性和发展潜力。目前，离子交换树脂已由最初在水处理工业中的应用，延伸到化工、电力、电子、环境科学、湿法冶金、分析化学、食品加工和医疗药物等领域中，形成一个独特的化工操作单元。离子交换树脂是能在水溶液中交换离子的固体，其巨大分子可以分成两部分：一部分是不能移动的多价高分子基团，构成树脂的骨架，

26、不溶于酸、碱和有机溶剂，化学稳定性良好；另一部分是可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中进进出出，发生离子交换现象。例如将葡萄皮浸出的花色苷红色素浸提浓缩液，用磺酸型阳离子交换树脂进行纯化，可除去其中的糖和有机酸化合物等杂质，使色素产品得以纯化，并提高了色素产品的稳定性。1.2.2 大孔树脂分离大孔树脂分离大孔树脂(macro-reticular resin)又称全多孔树脂，是网状骨架结构中既存在小于5nm的微孔，又存在大于5nm乃至数十nm大孔的树脂。它是在聚合反应过程中加入惰性溶剂，此惰性溶剂对共聚物具有惰性，而对单体苯乙烯和二乙烯基苯又具有良好的溶解性。在聚合过程中，由于惰性溶剂的存

27、在，形成的共聚物颗粒内会产生相分离，最终在树脂骨架内形成大孔结构。体积较大的分子也能进入树脂的孔结构内部而接近无梗五加果色素提取及纯化工艺研究6离子交换树脂的功能基团，适合大分子的分离。其交换容量既可以很低，也可以很高。这类不含离子基团的网状结构高分子聚合物吸附剂，具有吸附性强，解吸附容易，机械强度好，可反复使用和流体阻力小等优点。早期在废水处理、维生素、抗生素分离纯化方面应用较多5 。大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺，近几年国内用大孔树脂分离提取天然色素的研究较多。就是将溶液通过大孔树脂，吸附其中的有效成分，再经洗脱回收，除掉杂质的一种纯化精制方法。大孔树脂的优点是：第一

28、，经大孔树脂吸附技术处理后得到的精制物可使有效成分高度富集，杂质少，能提高提取物的质量和水平。如人参茎叶中也含人参皂甙，可以提取出来作为药用。但含量低，用一般方法提取麻烦，而用大孔树脂吸附技术提纯后人参皂甙含量可达70%以上，很方便。第二，减小产品的吸潮性。经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除色素中大量的糖类、无机盐、粘液质等吸潮成分，增强产品的稳定性。第三，大孔树脂吸附技术能缩短生产周期，所需设备简单；免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序；节约包装，降低成本。1.2.3 其他其他纯化方法纯化方法近年来，国外研究者对采用另外一些方法分离花色苷进行了探索。(1) 高速逆流色谱HSCCC是近20年

29、发展起来的一种不用任何固态载体或支撑体的液-液分配色谱技术，其基本原理是利用样品在两相中分配系数的不同实现分离。与传统分析方法相比，HSCCC具有分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和粘染，制备量大和溶剂消耗量少等优点。Michael S6等采用HSCCC分离分析了接骨木果汁中的花青素，溶剂系统为正丁醇-TBME-乙氰-水，体积比3:1:1:5，流速5.0mL/min。夏明等7用HSCCC对提取得到的红曲色素进行分离，溶剂系统为石油醚-甲醇-乙酸乙酯-水，体积比3:6:5:4，流速1.0mL/min，将一种黄色素与一种紫红色素分离。(2)毛细管区带电泳Ruben Saenz-Lope

30、z等8首次提出了在酒样品中采用毛细管区带电泳(CZE)法定量花色苷，研究了花色苷在碱性媒介中采用该方法分析的可行性。结果发现花色苷在碱性媒介中比在酸性媒介中更能被快速分离，CZE方法的结果可以和HPLC相比较。跟HPLC相比，CZE表现出较好的灵敏性、重复性和精确性。此外，有最短的装置时间，减少了成本以及试剂的用量，能在更短的分析时间内得到较好的分离效果。因此，对于定量分析酒中的花色苷，CZE是一种有效的方法。1.3 无梗五加的研究概况无梗五加的研究概况无梗五加(Acanthopanax sessiliflorus)为五加科五加属植物，生于海拔 2001600m的森林灌木丛中。分布于东北、华北

31、、陕西等地。在山地、溪流两岸、丘陵坡地、林沈阳农业大学学士学位论文7缘及灌木丛中也有生长。其根皮为五加皮，始载于神农本草经 ，列为上品。五加科主要的药用植物有刺五加、人参、西洋参、三七、竹节参等。刺五加具有人参样作用，能调节中枢神经系统，增强机体免疫能力，抗疲劳，抗衰老，亦对内分泌系统及造血系统有显著的药理活性。由于长期以来，在东北地区，将无梗五加当作刺五加药用，未见不良反应报道。为扩大药用资源，无梗五加引起了国内外学者的浓厚兴趣，他们对其化学成分及药用活性进行了深入且系统的研究1。目前已经研究了解到，可以从无梗五加中分离得到苷类成分(强心苷9、胡萝卜苷即刺五加苷10、刺五加苷类化合物11、三

32、萜皂苷12)、木脂素13(芝麻素和洒维宁)、甾体类化合物14(豆甾醇，菜油甾醇和 -谷甾醇)、脂肪酸类化合物和多糖类1。本草记载：无梗五加的根皮即五加皮具有祛风湿、补肝肾、强筋骨 、活血脉等功效、用于治疗风寒湿痹、腰膝疼痛、筋骨凄软、小儿行迟、体虚嬴弱等病症15。随着对无梗五加的进一步开发和利用，现在人们用无梗五加制剂治疗白细胞减少症16、眩晕症17，及妇女更年期综合征18。由此可见，无梗五加的药理学有了更进一步的研究，现概述如下：(1)抗炎镇痛作用：无梗五加对大鼠角叉菜胶、蛋清、甲醛有显著抑制作用，对热烫性足肿胀、巴豆油气囊肿的肉芽组织增生及渗出物均有显著抑制作用，对急慢性炎症也有明显抑制作

33、用，能明显抑制佐剂性关节炎，示其为治疗关节炎的良好药物，同时也证明它有免疫抑制作用。(2) 抗应激作用：无梗五加能非常显著地提高小鼠在低压缺氧条件下的存活率，明显延长其游泳时间；能非常显著地增强异戊巴比妥钠促睡眠时间，其作用与刺五加相似，甚至强于刺五加19。(3) 解热镇痛作用：对小鼠腹腔注射无梗五加醇提物，能起到明显的解热镇痛作用，与吗啡相似，但作用较吗啡缓和。(4) 对心血管的作用：无梗五加乙醇提取物的未脱脂制剂对离体蟾蜍心脏有明显的抑制作用，使蟾蜍在位心脏幅度减小；还可使麻醉兔的血压下降，并能降低家兔血管的通透性。(5) 其它作用：无梗五加对家兔离体肠及子宫均有兴奋作用1。1.4 本文研

34、究内容及目标本文研究内容及目标无梗五加具有如此多的功效，目前人们对五加根、茎、叶的研究十分多，但对五加果的研究却很少，而且天然食用色素越来越被人们重视并加以利用。所以为了资源无梗五加果色素提取及纯化工艺研究8利用提供依据，寻找一种安全可行且利用率高的天然色素作为食品添加剂。故本课题以无梗五加果为原料，对其色素的浸提工艺及在大孔树脂上的吸附和解吸特性进行了研究，并对纯化的无梗五加果色素的组成进行了初步定性分析，结果可为无梗五加果色素的开发利用和工业生产提供参考20。沈阳农业大学学士学位论文92 材料和方法材料和方法2.1 试验材料试验材料无梗五加(Acanthopanax sessiliflor

35、us)粉末(沈阳农业大学果蔬实验室提供)2.2 试验试剂试验试剂95%乙醇，无水乙醇，盐酸，乙酸乙酯，蒸馏水大孔吸附树脂：HPD400、HPD450、HPD600、HPD700、HPD750(沧州宝恩化工厂生产)氨水，碳酸钠溶液，98%的浓硫酸，盐酸，镁粉2.3 试验方法试验方法2.3.1 无梗五加果色素提取条件的研究无梗五加果色素提取条件的研究将0.5g干燥无梗五加果粉末放入三角瓶中，加入一定体积的提取剂，密封好后于一定温度水浴中浸提，将提取液过滤，收集滤液即制得色素提取液。于400800nm波长范围内进行扫描，测定不同种类提取剂提取无梗五加果色素的最大吸收波长并观察色素提取液的颜色，以确定

36、提取剂种类。将色素提取液定容至相同体积，以色素提取液的吸光度为考察指标，进行浸提温度、提取剂用量及浸提时间的筛选，并在此基础上，进行正交试验，确定色素浸提的最佳工艺。2.3.2 最佳树脂的选择最佳树脂的选择准确称量树脂各0.5g和20mL供试液(浓度为30%的色素溶液)，置于三角瓶中，放在全温振荡培养箱中(转速130r/min)，24h后取出。过滤，调波长为520 nm，测滤液的吸光度A1，记录。用95%的乙醇10mL洗脱滤出的树脂，放置24h后过滤，测A2。根据吸附与解吸的结果，确定最佳树脂。吸附率按式(1)计算，解吸率按式(2)计算20X(A0-A1)/A0 100 _(1)YA2/ (A

37、0-A1) 100 _(2) 其中X吸附率，%；Y解吸率，%；A0吸附前样品吸光度；A1吸附后样品吸光度；A2解吸后样品吸光度。2.3.3 静态试验静态试验2.3.3.1 pH 对树脂吸附性能的影响准确量取5份调至不同pH值的20mL供试液，测其吸光度。分别加入盛有0.5g活化树脂的50mL烧杯中，于室温下静置吸附2h后，测定上清液的吸光度并折算成吸附率。确定吸附最佳pH值。无梗五加果色素提取及纯化工艺研究102.3.3.2 洗脱剂(乙醇)浓度对树脂吸附性能的影响准确称取5份0.5g饱和树脂，分别加入不同浓度的乙醇溶液20mL，于室温下静置解吸2h后，测定上清液的吸光度(分别以相对应的乙醇溶液

38、作参比)。确定洗脱剂(乙醇)浓度对解吸的影响。2.3.3.3 洗脱剂的 pH 对解吸的影响准确称取5份0.5g饱和树脂，分别加入调至不同pH值最佳浓度的乙醇溶液20mL，于室温下静置吸附2h后，测定上清液的吸光度(分别以相对应的乙醇溶液作参比)。确定洗脱剂(乙醇)的pH值对解吸的影响。2.3.4 动态试验动态试验2.3.4.1 上样液与装柱量比例的确定准确量取5g活化树脂装柱，将色素以确定的流速1mL/min加入树脂，定量测定流出液的吸光度，确定适宜的上样液与装柱量的比例。2.3.4.2 洗脱剂用量的确定准确量取5g活化树脂装柱，将色素以确定的流速1mL/min加入树脂，用最佳洗脱剂以同样的流

39、速洗脱，定量测定流出液的吸光度，确定洗脱剂的用量。2.3.5 化学显色法鉴定无梗五加果色素化学显色法鉴定无梗五加果色素通过花色苷类化合物的显色反应，如色素在可见光和紫外光下的自然显色，以及发生的一些还原反应和与碱性试剂的显色反应，可初步鉴定无梗五加果色素的组成。显色反应现象见表2。表表2 花色苷类化合物的显色反应花色苷类化合物的显色反应氨定性方法可见光下紫外光下可见紫外碳酸钠浓硫酸盐酸镁粉反应现象粉红橙或红紫暗红蓝色浅蓝蓝色黄橙红褪为粉红3 结果与分析结果与分析3.1 无梗五加果色素提取条件的研究结果无梗五加果色素提取条件的研究结果3.1.1 提取剂种类的选择提取剂种类的选择沈阳农业大学学士学

40、位论文11表表3 无梗五加果色素在不同溶剂中的提取效果无梗五加果色素在不同溶剂中的提取效果溶剂50%乙醇70%乙醇95%乙醇蒸馏水甲醇乙酸乙酯无水乙醚石油醚max540540410540440410540410A1.4610.351.20.350.450.80.14颜色红红棕黄暗红棕褐黄绿浅黄绿浅黄注：提取条件：溶剂用量 50mL，提取温度 20，提取时间 2h.由表 3 可知，在提取条件一定的条件下，无梗五加果色素在不同溶剂中的提取效果并不相同。其中以 50%乙醇、70%乙醇、蒸馏水提取效果较好，提取液最大吸收波长均为 540nm，颜色为红色或暗红色，与无梗五加果颜色接近。三者之中，以 50

41、%乙醇为溶剂提取色素颜色最鲜艳，而且吸光度最大，因此，本实验选取 50%乙醇作为无梗五加果色素提取溶剂。3.1.2 提取剂提取剂 pH 的筛选的筛选表表4 提取剂提取剂pH的筛选的筛选pH135791113max525528530593550650655A2.0571.9481.3150.8860.7190.250.102颜色红红红灰黑黑褐咖啡色棕黄注：提取条件：提取剂 50%乙醇，溶剂用量 50mL，提取温度 20，提取时间 2h.由表 4 可知，不同 pH 的 50%乙醇提取无梗五加果色素的效果不同。所考察的 pH以 1、3、5 为佳。其中以 pH 为 1 的 50%乙醇提取效果最好，所得

42、色素溶液颜色最鲜艳，吸光度最大，但其 pH 过低，容易造成原料中其它成分的破坏而影响原料的综合利用，考虑 pH 为 3 的 50%乙醇溶液提取效果与其接近，因此，实验选取 pH 为 3 的 50%乙醇作为最终的提取剂，此条件下获得的色素溶液其最大吸收波长为 528nm。3.1.3 浸提温度对色素提取效果的影响浸提温度对色素提取效果的影响表表5 浸提温度对色素提取效果的影响浸提温度对色素提取效果的影响温度()20406080100A5282.6012.5812.6252.6222.620颜色红红红红红注：提取条件：提取剂 pH 为 3 的 50%乙醇，溶剂用量 50mL，提取时间 2h.无梗五加

43、果色素提取及纯化工艺研究12由表 5 可以看出，随浸提温度的提高，提取液颜色无明显变化。吸光度测定结果表明，随浸提温度的提高，提取液的吸光度减小，当升高到 60，吸光度达到最大，温度继续提高，吸光度基本不变。考虑到随浸提温度提高，提取液粘性增加，不利于过滤，因此，本实验选取 20作为浸提温度进行后序提取剂用量和提取时间的筛选。3.1.4 提取剂用量对色素提取效果的影响提取剂用量对色素提取效果的影响表表6 提取剂用量对色素提取效果的影响提取剂用量对色素提取效果的影响提取剂用量(mL)30507090110A5282.5802.5942.4072.1001.955注：提取条件：提取剂 pH 为 3

44、 的 50%乙醇，浸提温度 20，提取时间 2h.由表 6 可知，随提取剂用量的增加，提取液吸光度增大，提取液用量达到 50mL时，提取液吸光度达到最大，继续增加提取剂用量，提取液吸光度减小。因此，确定提取剂最佳用量为 50mL。3.1.5 浸提时间对色素提取效果的影响浸提时间对色素提取效果的影响表表7 浸提时间对色素提取效果的影响浸提时间对色素提取效果的影响时间(min)10306090120A5282.5652.5652.5922.6112.575注：提取条件：提取剂 pH 为 3 的 50%乙醇，溶剂用量 50mL，浸提温度 20.由表 7 可知，随浸提时间的延长，提取液吸光度增大，当提

45、取时间达到 90min 时，提取液吸光度达最大，继续延长浸提时间，提取效果下降。所以浸提时间以 90min 为佳。3.1.6 正交试验确定无梗五加果色素提取的最佳条件正交试验确定无梗五加果色素提取的最佳条件由表 8 可以看出，所考察的三个因素对无梗五加果色素提取效果的影响由大到小依次为：提取剂用量、浸提温度、浸提时间。提取剂用量对色素提取效果影响最大。正交试验结果表明，无梗五加果色素提取的最佳条件为 A3B1C2，即浸提温度 60，提取剂用量 30mL(即料液比 1:60)，浸提时间 60min。沈阳农业大学学士学位论文13表表8 无梗五加果色素提取的正交试验无梗五加果色素提取的正交试验试验号

46、A 浸提温度()B 提取剂用量(mL)C 浸提时间(min)吸光度(A)120(1)30(1)30(1)2.733220(1)60(2)60(2)2.671320(1)90(3)90(3)2.372440(2)30(1)60(2)2.712540(2)60(2)90(3)2.692640(2)90(3)30(1)2.441760(3)30(1)90(3)2.719860(3)60(2)30(1)2.671960(3)90(3)60(2)2.520K17.7768.1647.845K27.8458.0347.903K37.917.3337.783k12.5922.7212.615k22.6152

47、.6782.634k32.6372.4442.594R0.0450.2770.04注：提取剂 pH 为 3 的 50%乙醇.3.2 最佳树脂的确定最佳树脂的确定大孔吸附树脂的筛选结果见表 9。由表 9 可以看出：HPD450、HPD600 和 HPD700都具有较大的吸附率，且 HPD450 的解吸率更高，受试验条件所限，本试验选用HPD600 作为筛选后的最佳树脂。无梗五加果色素提取及纯化工艺研究14表表9 不同树脂对色素的吸附和解吸效果不同树脂对色素的吸附和解吸效果树脂类型HPD400HPD450HPD600HPD700HPD750吸附率(%)80.1586.2687.0286.0142.

48、24解吸率(%)82.2296.1780.1284.7981.333.3 静态试验静态试验3.3.1 pH 对对 HPD600 树脂吸附性能的影响树脂吸附性能的影响无梗五加果色素在 pH 值 15 范围内溶液颜色最鲜艳，吸光度最大，故研究 pH值在 15 范围内树脂对色素的吸附。由表 10 可见，树脂在 pH 值 3.0 时对色素吸附率较高，而 pH 值 1.0 时吸附率较低，因此 pH 值 3.0 利于色素吸附，定为吸附的最佳 pH值。表表10 不同不同pH值条件下值条件下HPD600对色素的吸附对色素的吸附pH值吸附前吸光度值吸附后吸光度值吸附率%1.00.4610.15267.0281.

49、50.4490.14667.4832.00.4450.13769.2132.50.3930.09176.8453.00.3650.07679.1795.00.3670.07978.4743.3.2 洗脱剂洗脱剂(乙醇乙醇)浓度对树脂吸附性能的影响浓度对树脂吸附性能的影响洗脱剂都具有使大孔树脂溶胀，减弱吸附物质与树脂之间的吸附力的作用，并可溶解被吸附物质。常用的洗脱剂是低级醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮，考虑到食品生产安全性等方面的要求，本试验使用乙醇作为洗脱剂21。由图 2 可知，随乙醇浓度增大，色素洗脱量呈现先增大后减小的趋势，故乙醇浓度为 60%时，对无梗五加果色素的洗脱效果最

50、好。沈阳农业大学学士学位论文150102030405060705060708090乙醇浓度(%)解吸率(%)图图2 乙醇浓度对解吸的影响乙醇浓度对解吸的影响3.3.3 洗脱剂的洗脱剂的 pH 对解吸的影响对解吸的影响由于无梗五加果色素在 pH 值 15 范围内溶液颜色最鲜艳，吸光度最大，故研究pH 值在 15 范围内洗脱剂的 pH 对解吸的影响。由图 3 可知，在 pH 值为 1.5 时，解吸率最大，为峰值，故选用 pH 值为 1.5 的乙醇作为最佳洗脱剂。405060708011.522.533.55pH值解吸率(%)图图3 洗脱剂的洗脱剂的pH对解吸的影响对解吸的影响无梗五加果色素提取及纯

51、化工艺研究163.4 动态试验动态试验3.4.1 上样液与装柱量的比例上样液与装柱量的比例确定确定随上样量的增加，经大孔树脂吸附后的流出液的吸光度逐渐增大，即流出液中色素含量增加。当达到一定值时，吸光度趋于不变。由图 4 可知，当上样液为 50mL 时，大孔树脂达到饱和，即上样液与树脂用量比例为 10:1 时，树脂对色素的吸附率最高，达到 96.32%。因此，试验确定二者用量比例为 10:1。0.140.150.160.170.180.190.20.210.22102030405060708090100上样量 (mL)吸光度A图图4 上样液与装柱量的比例上样液与装柱量的比例3.4.2 洗脱剂洗

52、脱剂用量的确定用量的确定采用体积分数 60%的乙醇进行解吸，由图 5 可知，当用量达到 70mL 时色素基本上被洗脱下来。沈阳农业大学学士学位论文1700.050.10.150.20.250.30.35102030405060708090100上样量(mL)吸光度A图图5 洗脱剂与装柱量的比例洗脱剂与装柱量的比例3. 5 化学显色法定性鉴定无梗五加果色素化学显色法定性鉴定无梗五加果色素经过花色苷类化合物的显色反应做出的结果见表11。表表11 花色苷类化合物的显色反应花色苷类化合物的显色反应定性方法定性反应现象试验结果结论可见光下粉红橙或红紫红紫+紫外光下暗红至棕暗红+可见蓝色蓝色+氨紫外浅蓝浅

53、蓝+碳酸钠蓝色蓝色+浓硫酸黄橙黄橙+盐酸镁粉红褪为粉红红褪为粉红+注： “+”代表反应呈阳性.由表 11 可知，反应均呈阳性，故可以初步确定无梗五加果色素为可溶性花色苷类。无梗五加果色素提取及纯化工艺研究184 结论结论4.1 无梗五加果色素的提取条件无梗五加果色素的提取条件研究表明：无梗五加果色素在不同条件下其提取效果不同，提取剂种类为50%的乙醇溶液；pH为3；20作为浸提温度；提取剂最佳用量为50mL；浸提时间以90min为佳。满足以上条件的提取剂为无梗五加果色素的最优提取剂。4.2 无梗五加果色素的纯化条件无梗五加果色素的纯化条件在进行筛选的5种树脂中，HPD600对色素的吸附量大，吸

54、附率高，易解吸，是一种理想的色素吸附剂，适宜于对色素的提取分离。HPD600对无梗五加果色素的最佳纯化工艺条件为：原料浓度30%，pH值为3,上样液与装柱量的最佳比例10:1(mL:g)，控制流速为1mL/min；最优洗脱条件为：以70mL体积分数为60%，pH为1.5的乙醇解吸。4.3 无梗五加果色素组分的初步分析无梗五加果色素组分的初步分析通过花色苷类化合物的显色反应，可看出其显色反应结果与花色苷类色素的显色反应结果一致，故可以初步确定无梗五加果色素属于水溶性花色苷类。5 讨论讨论5.1 影响大孔吸附树脂纯化植物化学成分的因素影响大孔吸附树脂纯化植物化学成分的因素影响树脂吸附的因素很多，主

55、要有被分离成分的性质(极性和分子大小等)、上样溶剂的性质(溶剂对成分的溶解性、盐浓度和pH值)、上样液浓度及吸附流速等。通常，极性较大分子适用中极性树脂上分离，极性小的分子适用非极性树脂上分离；体积较大化合物选择较大孔径树脂；上样液中加入适量无机盐可以增大树脂吸附量；酸性化合物在酸性溶液中易于吸附，碱性化合物在碱性液中易于吸附，中性化合物在中性液中吸附；一般上样液浓度越低越利于吸附；对于滴速的选择，则应保证树脂可以与上样液充分接触吸附为佳。影响解吸条件的因素有洗脱剂的种类、浓度、pH值、流速等。洗脱剂可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，应根据不同物质在树脂上吸附力的强弱选择不同的洗脱剂和不同的洗

56、脱剂浓度进行洗脱；通过改变洗脱剂的PH值可使吸附物改变分子形态，易于洗脱下来；洗脱流速一般控制在0.55mL/min。工业上，树脂柱经反复使用后，树脂表面及内部残留许多非吸附性成分或杂质使柱颜色变深，柱效降低，因而需要再生，一般用95%乙醇洗至无色后用大量水洗即可。总之，吸附条件和解吸附条件的选择直接影响着树脂吸附工艺的好坏，因而，实沈阳农业大学学士学位论文19验中应综合考虑各种因素，确定最佳吸附解吸条件。无梗五加果色素提取及纯化工艺研究20参考文献参考文献1 淳于家龙,郭丽娜,张长顺.无梗五加化学成分与药理活性的研究进展J.中国药业2002,11(12):73-74.2 庞志申.花色苷研究概

57、况.北京农业科学.2000,18(5):37-42.3 袁海波,童华荣.天然食用色素花青素应用研究进展,广州食品工业科技,17(3):75-77.4 杨虎清,黄素娟.食品色素的过去、现在和未来中国食品添加剂.2002(3):10-14.5 钟瑞敏.葡萄花色苷优化提取和纯化工艺研究.韶关大学学报1995,12(8):113-121.6 Michaels,Silke H.Application of hish-speed counter current chromatography to the large scale isolation of anthocyaninsJ.Biochemical Engineering Journal,2003,14:179-189.7 夏明,杜琪珍.高速逆流色谱提取分离红曲色素的研究.广州食品工业科技,2002,18(4):15-17.8 Michael Schwarz,Silke Hillebrand,Saskia Habben.Andreas Degenhardt,Peter Winterh