多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪

1、多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪联接与应用技术MALLS/GPC(SEC)多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪的联接与应用WYATT TECHNOLOGY CORPORATION.一刖吕近十儿年來，光散射技术(Light scattering)在高分子特征分析领域的应用得到了迅 速的发展。将光散射技术和凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography, GPC)或尺 寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography)分离技术相结介，不但可以测得大分子 的绝对分子量，分子旋转半径与第二维里系数，还可测得分子量分布，分辨分子帚:大 小不同的族群以及分子的形

2、状，分枝率及聚集态等。目前，该技术己成为一种非常有 效的工具，在美国，口木及欧洲己广为使用，国内近年來亦引进了此项技术。二光散射简介早在I 九世纪初，人们就开始对光散射原理进行研究。riA I 年代激光被发明以來, 光散射的原埋与技术便得以迅速发展，至今已成为检测微小粒子形状，粒於大小，分 子量，界面电位及粒子间效应的匝要工具。随着电脑技术的H新月异，许多过去需花 费数小时共至数11才能完成的实验，如今只需数分钟即可完成，而其准确性及重现性 也大幅度提高了。光散射现象，如图1所示，当一束光通过一间充满烟雾的房间就会产生散射。利用 在不同角度，不同时间所测得的光散射强度，再借助各种光学理论及软件

3、，硬件设备, 就可以测得微粒的许多特性。入射光散射光 图1光散射现彖在光散射发展的历程中，以下是一些具有代表性的人物：James Clerk Maxwell (1833-1879)解释了光是一种电磁波，并正确地计算出光的速度。 Lord Rayleigh( 1842-1919)研究了远小丁波长的微粒散射现象，发现了散射强度与波长的四次方成反比，并解释了蓝天被太阳光穿透大气层所产生的散射现象。 Abert Einstein( 1879-1955)研究了液体的光散射现象。A Chandrasekhara V. Raman (1888-1970)印度籍物理大师，提出了 Raman效应，其著作多次发表

4、丁印度文期刊，虚至第二次 世界大战结束后才逐渐被人所知。 Peter Debye (1884-1966)延续了 Einstein的理论，描述了分子溶解丁溶剂中所产生的光散射现象,提出用Debye plot,求得重量平均分子最Mwo三光散射理论激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，丁是我们可以在一个角度或多个角 度收集散射光的强度。1. 光散射所透露的信息在任何方向的光散射强度与分子量和溶液的浓度成疋比：散射光角度的变化与分子 的尺寸大小有关。当分子小J" 10nm时，各个角度的散射强度都相同：当分子介10 至30nm时，散射强度则由低角度向高角度呈IT线下降的趋势;而当分子大J&

5、#39;" 30nm时, 散射强度则随角度增大呈曲线下降的趋势。2. 基本理论由Maxwell, Einstein, Debye及Zimm等人陆续发展起來，有关溶剂中分了駅的 光散射现彖可由下列公式表达：K*c1+ 2A?cmwp(q)(1)式中：常数 K=47r2(dn/dc)2no2(NAXo4) 是溶剂的折光指数。C是溶质分子的浓度(g/mol)。M是阿佛加徳罗常数。入。是入射光的波长。DN/DC是溶液折射率与浓度变化的比值，它说明了随溶质浓度变化的溶液折光指数 变化。R(B)是单个角度的散射光(大于溶剂的散射光数最)除以入射光强度所得的分数即 不同角度光散射强度。Mv是重均分

6、子最。是第二维电系数P(B)是光散射强度的函数 将40)代入式(1)展开得：=1 £1艸如川韵+2/0Mur在上式中，/?(0)是测得值，K*c、A朋为输入值，均为已知值；而販、仏为未 知值。3. Zimm Plot如图2所示，其中K将K* C/ Ro对sin2(q+辰作图，可得到著名的Zimm曲线, 为调整横坐标的设定值。c 二 °4图 2 Zimm Pio当e - 0时，(2)式简化为斜率即是A2k*+ 2A2CR(0)当Cf 0时.(2)式简化为 斜率是r/等当e0, c- 0,(2)式简化为K*1_R(0) M在纵朋标上交点的倒数即为恤。实验的方法为配制一组不同浓度

7、的溶液，依次在 不同的角皮测量其散射光强度，由计算机程序按照上列的公式绘出ZhnmPlot,并求得 Mw, <r：>h值，这是极少数能H接测得绝对分子量的方法之一。但由于结果仅为单 一平均值，因此较适用于成分单一，分布较窄的分子，对于分布较宽或有不同族群分 布的样品，则较难看出全貌。四光散射与GPC/SECGPC/SEC可以将溶剂中的分子按重最或尺寸大小依次洗脱出來。利用此项技术将 光散射仪器与GPC/SEC联用，除了可以分岀不同的族裙，还可测得不同族群的分布， 并且不需耍另外标准样品做标准曲线。由丁光散射信号氏接与分子鼠大小有关，因此可以市接测出重均绝对分子最，并获得其它许多有关

8、的信息。A90AUX10 5110.012014.016.018.0Volume (mL)20.0图4光散射强度与GPC层析图Ch rom atography with LS Set-up图5光散射强度与GPC/SEC联用1 Debye plot通常GPC/SEC的样品注射浓度就很低，再经过色谱柱得到进一步的稀释，图4 中光散射信号上的任何一点，其浓度都极低(趋近丁零)。根据公式，当2«CtO,将K* C/ 对sin2(q/2)+k作图6,其纵坐标交点即为1 /Mw,由氏线的斜率可得 图4光散射信号的每点都可以得到上述结果，由此可以求得分子暈及旋转半 径/的分布，如图7所示：88x1

9、0'6 00x104.00x10200x100.000.60.81.0sinTtbeta)0.0Peak. Slice : 1. 184V O CAT0X1图 6 Debye plot(OUV6) sse 乏eo乏1.0x1038.5+ HEPARIN2Molar Mass vs. Volume9.09.510.010.5Volume (mL)图7分子鼠对洗脱体积作图11.011.51.0B 6 4 2 o o o MUOoEd 】>KAA(DAPEnEnoo o1 Ox1O3Cumulative Molar Mass1 oxin41 Ox IO51 0x10®Mola

10、r Mass (g/mol) LT1 r LT2LT3 LT41 0x1079图8积分分子量2分子形状不论是分布较宽或是多峰分布的样品，皆可通过测最分子最及分子旋转半径得到分 子形状的数据。球形分子?-,3 oo= & + 1/3 log Mi无规则线团状分子i2 oo= k + 1/2 log Mi棒状分子rj oo A/；>log 几=k + 1/1 log M将log® logM作图,有宜线的斜率可以获知分子的形状,如图9所示：1000.0(UJU) S.3P6M SWQ:图91 M. rg与分子形状的关系RMS Radius vs. Molar MassGATC

11、2_01054701100.010.01.01.0x10 41.0x10 51.0x10 6Molar Mass ©mol)1.0x10 710#图92构型判断山対M “作图。斜率0.54 土 0.01。表明分子是JW无规则线团构彖的线性聚介物#RMS Radius vs. Molar Mass100.0(UM) smp5S3&Molar Mass ©eoQeu)署&GATD4_010.68 ?0X)4GATD5_01 0.60 70041.0x1041.Ox1O51.0x106Molar Mass ©mol)图93构型判断，唧寸W，作图。斜率人T

12、 0.6,表明分了仇仃伸展结构。斜率为10,表明足棒状 结构。11#图94构型判断.rPX-t Mw作图“其IJ型曲线表明为胞型的禹支化度结构.3需要量多少个角度在低角度的时候，有杂质所产生的噪音信号干扰会很大，如图10所示，所以只取 低角度，加上九十度两个角度，其误差就会相对很大；若只取九十度则只能求得分子 暈，无法测得旋转半径，所以最起码要加上一组高角度來修正，则误差会较少很多。#图10杂质较多的GPC层析图#4光散射仪器最基本的仪器mini DAWN TREOS如图11所示,在与入射光成45度、90度、135 度角配置三组光电二极管检测器，同时检测不同角度的光散射强度，而激光经由样品 槽

13、的毛细管通道，样品槽为石英材质。如果耍增加测量角度，可以如DAWN HELEOS 在样品槽的两侧以不对称得方式增加检测器的数H， 如图12所示可高达18个角度之多。Solvent°)& Observed angle图11三个检测角度0 scattering angleGlass Cell五应用光散射强度与分子的大小及分子量有H接的关系，而SEC/GPC能分离不同尺寸及 分子鼠的分子，结合此两种特性，可以得到许多有用的信息，并广泛地应用丁高分子, 生化及动力学等研究领域。图12十八角度检测器1高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系统(Multi-Angle Laser Ligh

14、t Scattering MALLS)结 合SEC/GPC,不必依赖泵的流速，校正曲线及其它任何的假设，即町氏接求得重均绝对 分子最及分子量分布等数据。Intensit图13光散射强度，洗脱体积与角度作图图14这是由ASTRA软件得到的miniDAWN （上）和Optilab示差检测器（下）信号。MALLS利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射量（如图13）,由RI检测 器得到的洗脱液浓度及dn/dc值，即可计算出各个切片的分子量。MALLS测得绝对分 子最所需的各种物性均可由实验吃接求得，无需作任何假设。而GPC的色谱柱乂有分 离杂质的功能，可以避免传统的光散射需极小心准备样品的麻烦。图1

15、4显示高分子混 介物经SEC分离后MALLS及RI的洗脱体积对照图。由此图看出RI对大分子最浓皮 低的物质较不敏感，而对低分子量高浓度者较敏感。13#1BSA67.00064,300±7001%2溶解酵素 11,30014.600±3001%3缓激肽 1,0601,090±102%4亮氨酸脑叫妣556592±63%14图15分子量对洗脱体积图,有四个明显的峰2.蛋白质及其聚合体在各种工业应用屮，决定蛋白质的绝对特性不仅严格而且必耍，例如在生化工程 应用上，以蛋白质为皋质的产品必须很纯而且无任何聚集存在。而测泄蛋白质的分子 量和是否有聚集态存在，光散射法是

16、瑕理想的工具之一。以往，在水相屮用低角度光散射测直法（LALLS）受到溶剂中不纯的物质干扰相当 大。而MALLS的多角度测量人大降低了背景噪盲的干扰，并能提供完整的信息和良 好的重现性结果。图16显示蛋白质混合物的MALLS和RI的信号。样品在0.1M NaCl 中含0.05M的磷酸盐缓冲液中进行RI为Wyatt Optilab 903,流速为L/min,色谱柱 为Shodex KW-8O3和KW-804o虽然此样品为标准样品，但MALLS仍很清楚地检测 到聚集现彖，此现彖在R1儿乎无法辨认。1.0x10®1.0x107(-og)sseHJelow1.0x1061.0x10s1.0

17、x104120.0Molar Mass >/ Time22.024.026.028.030.0Time (min)图16蛋门质洗脱体积及聚集体信号图BSA-2SB m BSALSB3.分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影响其物理和化学性质的一个巫要因索。采用 多角度激光光散射系统（MALLS）与GPC/SEC系统联用是唯决定分枝系数即的方 法。虽然也有其他确定分枝的方法，但都不能也接且需要众多假设及“虎拟因子”。由传统的R1或Viscometer （粘度检测器）测泄的筒枝化分子的分子臺与绝对值育 很大的差别，若欲做有效的色谱柱校正，则需以一系列与待测物成分相同的标准品作 校若标准样阳与待

18、测物的成分或组分不同，则会产生很大的渓怎。例如分子相16同的球形局分子的洗脱时间比无规则线团状分子要长。因为MALLS所求得分子量和大小为绝对值，因此计算分枝系数gM不需耍任何假 设。由MALLS H接所求得的分子大小会克接影响分枝率。对分子最相同的长链状分 子而言，其值越小，则分枝程度越大。分枝比的定义为分枝分子的旋转半径与长链分 子的旋转半径之比，即gM=<r>b/<r2>i由MALLS测得。图17为由MALLS测得的分枝状和长链形的高分子（PS）的旋转半径和分子帚对 照图。由图中可看出，虽然其分子最相同，但分布明显不同。图18为怎对Mw做图。1（H ）(UW)SP

19、EHSS1k1DrMolrtculor Woiohl图17 PS线形与枝化分子的对照图 Algma teG 333 = 0 0T2 se-i rrcc atedC983 0 027图18旋转半径对分子量图（分子构型图），可以看出样品（藻酸钠）在辐射后分子构型的变化。6.动力学/反应速率MALLS还可以用丁如抗原，抗体等反应迅速的溶液系统，粒子和蛋白质聚集现象的检测。I大1为MALLS内部同时装有数个固定的检测器，所以不需移动任何仪器唤件 來扫描样品，即可及时多方位同时捕捉反应速率的现象。使用MALLS,可研究抗原. 抗体反应，反应发生时就可决定聚集粒子的大小。当改变温度，浓度或催化剂时， MA

20、LLS可记录下反应发生时，分子的特殊变化。4500Protein Mass vs< Concentration00.20.40.60.81Concentration (mg/mL)18#图19浓度变化对蛋门聚集的影响使用DAWN检测器研究了浓皮对分子最为75KD单分子蛋口质聚集作用的影响。图 19描述了这种特殊蛋白质从30ug/ml到lmg/ml范围内得到的浓度相关性。如图所示, 该蛋口质在低浓度作为单一分子而在浓皮大丁700ug/inl时聚集为六聚体。该结果与由 gluteraldehyde高度交联技术所得结合完全相符。o,心O图20温度变化对PMMA分子届和人小的影响.0 t tr #7低分子最的测定DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固泄光电二极管检测器叫以捕捉到很微#弱的光散射信号，使得分子帚:的测定成为町能。使用DAWN系列标准配制的任何一款 激光器，都可以轻易地测最分子量低T 2000D的聚合物，并具有相当的准确性。由T DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS具有三个以上的多角度同时捕捉散射信 号的能力，即使极