第3章初级分离

1、第三章第三章初初 级级 分分 离离b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g思考题1.常用的沉淀法有哪几种？简述各自的沉淀机理。2.生产中常用的盐析剂有哪些？其选择依据是什么？3.何谓分步盐析沉淀？4.有机沉淀法与盐析沉淀法相比有何优缺点？ b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g初级分离初级分离n定义：从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程n特点：体积大、杂质含量高，浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化

2、倍数低等n技术：沉降、过滤、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级、泡沫分离b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g本本 章章 重重 点点1）蛋白质沉淀分级原理，沉淀方法分类，影响溶液稳定性有哪些因素？2）盐析概论及影响盐析效果主要有哪些因素？3）有机溶剂沉淀机理及影响因素。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1 沉淀分级n定义：定义：物理 环境的变化引起的溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象n常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出

3、。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。n与结晶联系与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。n区别区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g优点优点n设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； n原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；n使中间产物保持在一个中性温和的环境；n及早地将目标蛋白质.从其蛋白质.水解酶分离出来，避免蛋白质降解，提高产物稳定性；n用沉淀法作为蛋白质

4、色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。缺点：缺点：n沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；n过滤较困难b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g 蛋白质溶解：蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性：亲水性和疏水性：1.1 蛋白质表面特性b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1) 水化层水化层(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g 蛋白质)loose hydrati

5、on shell(2g water /1g 蛋白质)2) 静电排斥静电排斥 zeta电势电势nernst potential胶核表面电位(不可测)stern potential(不可测) potential滑面电位(可测,mobility) 电位 nernst电位 ionic strength3) |ph水水 pi| value |ph水水 pi| value zeta电势电势 水化层水化层 静电排斥静电排斥 tight hydration shell蛋白质tein coreloose hydration shell 蛋白质溶液的稳定因素b i o s e p a r a t i o n e

6、n g i n e e r i n g蛋白质沉淀方法1）原理n降低水化层厚度n降低双电层厚度（电位）2）关联因素 电解质种类、浓度、ph等eg: |ph水水 pi| value |ph水水 pi| value zeta电势电势 水化层水化层 静电排斥静电排斥 b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g3） 分类u 盐析法盐析法u 等电点沉淀等电点沉淀u 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法u 热沉淀热沉淀u 非离子聚合物沉淀法u 聚电解质沉淀法u 金属离子沉淀法b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n

7、 g1.2 盐析沉淀定义在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程 蛋白质生理离子强度范围：0.150.2mol/kgb i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g 1）机理：）机理：a、减弱静电斥力（zeta potential）； b、去水化膜（hydration shell）b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g盐析沉淀平衡式： log s = ks i 其中： s：蛋白质溶解度，g/l : 常数；与蛋白质、温度、ph 有关，与盐析剂种类无关 ks: 盐析常数； 与蛋

8、白质、盐析剂种类有关，与温度、ph 无关 i: 离子强度，mol/lb i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g2) 影响因素n无机盐种类n浓度n温度nphb i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n ga、无机盐种类感胶离子序(hofmeister序列): in 1888，hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- f- io-3 h2po-4 so-4 ch3coo- cl- clo-3 br- no-3 clo-4 i- cns-;

9、对阳离子排序为： th4+ al3+ h+ ba2+ sr2+ ca2+ cs+ rb+ nh4+ k+ na+ li+b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g结论：结论：a不同种类的盐主要影响ks；b离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。无机盐的挑选原则：无机盐的挑选原则：a较高的盐析效能；b高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c溶解度受温度的影响小；d盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e不易引起蛋白质的变性；f价格低廉；最常用最常用(nh4)2so4 优点：符合上述要求； 缺点：水解后溶液ph降低，在高 ph下产氨，腐蚀

10、性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。次常用次常用na2so4 缺点：在400c以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n gb、温度和ph值t ， ；t ， 。t影响cohn方程中的值t ， ，s t ， ，s 特殊：高离子强度特殊：高离子强度b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n gn溶液ph影响值 ph接近pi时，最小，s最小b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g方法方法: a、 “ks”分级盐析法：

11、在一定ph值及温度下，改变盐浓度（即i）达到沉淀的目的。b、“”分级盐析法：在一定i下，改变溶液的ph值及温度达到沉淀的目的。c、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g盐析操作方式及方法1)操作方式固体盐加入饱和盐溶液加入2)饱和度3)方法分步盐析重复盐析反抽提法b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g 盐析沉淀法的特点 1)沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活；2)非蛋白的杂质夹带沉淀很少；3)适用范围广；4)盐份含量高。

12、b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1.3 等电点沉淀法1）定义利用两性生物物质在等电点时溶解度最小而析出固相物的过程2）沉淀机理降低排斥电位和水化程度3）盐离子的影响使实际等电点 pi偏离（0.5）与阳离子结合， pi升高与阴离子结合， pi降低b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g等电点沉淀法中的ph值作用于值而隐含在cohnx公式中，pi值通常在ph46范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。为了提高等

13、电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。特点：沉淀条件温和；不引入新的物质；沉淀效果差。最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1.4 有机溶剂沉淀法定义在有机溶剂存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程同盐析一样，随着沉淀剂有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g机理：机理：a、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间

14、的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。b、有机溶剂使蛋白质溶剂化，使原来与蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了蛋白质溶解度。c、丙酮、乙醇等不仅是蛋白质的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使蛋白质在沉淀和变性之间既有区别又相关联。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1)降低介电常数2)对生物分子的变性作用小3)与水互溶4)安全、无毒、价廉、易回收等# 常用有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。有机溶剂的选择有机溶剂的选择b i o s e p a r a t i o n e n g i n

15、e e r i n g影响因素及控制影响因素及控制a、t：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液t显著升高，对不耐热的蛋白质影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失蛋白质活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10c下进行。b、乙醇：通常随乙醇上升，蛋白质溶解度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。c、ph值：在确定了乙醇以后，蛋白质最低溶解度出现在蛋白质的pi处，因此可以通过调节ph值来选择性分离蛋白质。d、蛋白质：避免使用很稀的浓

16、度，因蛋白质在高浓度下才较稳定。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g优点：优点：a、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，b、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；缺点：缺点：a、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；b、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性；c、收率也比盐析法低；d、试剂易燃，有毒。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g1.5 热沉淀n定义：n利用蛋白质间热稳定性差异进行的沉淀b i o s

17、 e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g五、高分子聚合物沉淀法1.定义利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的过程2.沉淀机理非离子型（聚乙二醇等）：类似于有机溶剂沉淀离子型（海藻酸盐、聚丙烯酰胺盐、聚乙烯亚胺）：有机溶剂沉淀+架桥b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g3、特点n沉淀效果较好，条件温和n高聚物的残留n有一定的毒性（阳离子）b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g六、金属离子沉淀法1.定义利用一些金属离子与目的物复

18、合，降低其复合物的溶解度而析出固相物的过程2.沉淀机理与羧基、胺及杂环等含氮化合物结合；如mn2+、fe2 + 、zn2 + 、cu2 +等与羧基结合，不与胺及杂环等含氮化合物结合；如ca2 + 、ba2 + 、mg2 + 、pb2 +等与巯基结合；如hg + 、ag + 、pb2 +等b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g3、特点n沉淀效果很好；n容易使生物分子变性n复合物难分解b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g8 非离子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（peg）、聚乙烯

19、吡咯烷酮（pvp）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是peg，相对分子质量从200d到20kd的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用peg-6000或peg-4000。计算公式：计算公式：式中，s-溶解度；c-peg浓度；-常数，受溶液条件的影响(如ph值和离子强度)；k-常数，由蛋白质大小和peg的类型决定。 适应条件：适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/l和高浓度蛋白质，如75g/l和150g/l时，实验结果会偏离线性。这时方程需校正b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g8. 非离子型聚合

20、物沉淀法 b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g8. 非离子型聚合物沉淀法优点：优点：a、体系的温度只需控制在室温条件下；b、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；c、peg非但不会使蛋白质变性,而且可以提高它的稳定性；d、peg无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。缺点：缺点：a、peg比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决；b、价格较昂贵。b i o s e p a r a t i o n e n g i n e e r i n g 9. 沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：a、热运动（brownian运动）；b、对流运动，由机械搅拌产生；c、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。第a、b两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第种机理在沉降过程中起主