血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

1、血清白蛋白分离与纯化血清白蛋白分离与纯化实验目的实验目的l1.了解血清蛋白质分离的一般方法l2.掌握盐析法、凝胶层析分离纯化白蛋白的方法实验原理实验原理l血清中主要蛋白：白蛋白与球蛋白l正常人血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的量保持相对恒定；总蛋白60-80克/升，白蛋白为40-50克/升，球蛋白为20-30克/升。 盐析法盐析法l中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电子层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。l利用白蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。血清白蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出，血清球蛋白在半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵溶液中沉淀析出。凝

2、胶层析凝胶层析1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术，是一种分子筛效应。2、当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。3、当样品通过层析柱时，分子量较大分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒间隙凝胶颗粒间隙，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短流程较短，向前移动的速度较快速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分质分质量较小的物质（硫酸铵）量较小的物质（硫酸铵），因为颗粒直径较小，可通可通过网孔而进入凝胶颗粒过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长流程较长，向前

3、移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。凝胶层析凝胶层析凝胶类型分离范围（Mr）应用G-251000-5000去盐G-753000-70000中等蛋白质分离不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用实验步骤实验步骤- -硫酸铵盐析硫酸铵盐析l取正常人血清2.0ml于小试管中，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液2.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000rmin离心10min。l用滴管小心吸出上层清液于另一试管中，作为纯化白蛋白之用。凝胶柱凝胶柱G-25层析除盐层析除盐1、装柱：、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一头朝下），将底部夹紧，注入约2.

4、0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-25疑胶搅成悬浮状加入层析柱内，慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝胶床表面要平整）。2、平衡：、平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱底部旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防止柱床流干)。凝胶柱凝胶柱G-25层析除盐层析除盐3、洗脱：、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品，小心缓慢的加到凝胶床

5、面，打开底口，使样品慢慢进入凝胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝胶床面，进行洗脱。4、收集：收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品，绘制洗脱曲线。凝胶柱凝胶柱G-75分离纯化分离纯化1、装柱：、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一头朝下），将底部夹紧，注入约2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-75疑胶搅成悬浮状加入层析柱内，慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝胶床表面要平整）。2、平衡：、平衡：在凝胶柱床上留有3cm

6、高的溶液，将层析柱底部旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防止柱床流干)。凝胶柱凝胶柱G-75分离纯化分离纯化3、洗脱：、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品，小心缓慢的加到凝胶床面，打开底口，使样品慢慢进入凝胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝胶床面，进行洗脱。4、收集：收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品，绘制洗脱曲线。紫外检测仪工作原理紫外检测仪工作原理 仪

7、器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即A=1g - =CL式中为待测样品的克分子消光系统，C为样品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。根据上式就知测出了A，就知样品浓度C。若从放大器直接输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。紫外检测仪的使用紫外检测仪的使用量程范围：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A紫外检

8、测仪主要技术指标：紫外检测仪主要技术指标： 1、调节光量旋钮，量程旋钮放置100%T档，使LED数字显示为100，T拨到A档，使LED面板上读数为0左右，若作透光度T测试，就可在层析柱上加样，对样品进行分离分析。 2、若做光密度A测试，把量程旋钮（即灵敏度）拨到所需光密度A，调节光量旋钮，使LED面板为0。此时记录仪回到零点附近（注：零点附近即可，在实验中可自来定）。 3、如绘出图谱峰值过小，把量程旋钮（即敏度）拨到所需位置。 4、在测试过程中，“光量”均不再变动。测试完毕，并用蒸馏水清洗样品池和管道。紫外检测仪记录仪紫外检测仪记录仪 1、量程一定用10mv。 2、走纸速度：G25，2A，5 cm；G75,1A，1-2 cm。紫外检测仪使用方法：紫外检测仪使用方法： 1、首先将主机和记录仪二部分电路接妥，然后把主机的电源插头插入220V电源插座上。2、出厂前波长设定280nm，若所需其它波长，只