三种荧光定量PCR检测方法比较

1、三种荧光定量 PCR 检测方法比较三种荧光定量PCK测方法比较定量 pcr ：以参照物为标准，对 PCR 终产物 进行分析或对 PCR 过程进行监测，从而达到评 估样本中靶基因的拷贝数，称为定量 PCR 。定 量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指 数期进行的。常见 荧光定量 PCR 检测方法可分为以下几 类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合 发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后， 荧 光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信 号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光 信号检测出 PCR 体系存

2、在的双链 DNA 数 量。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为 520nm。PCR扩 增程序一般为 94 C55 C72 C三步法，40 个循环。 SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只 要是双链就会结合发光， 对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底 较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双 链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制 不同的特异性探针，通用性较好，并

3、且价格相对 较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研 中使用比较普遍。SYBR GREEN I工件原理(2) 水解探针模式(taqman探针)TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基 团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末 端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧 光因与3'端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延 伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子 的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生 随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不 断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧 光。PCR扩增程序通常是：94

4、 C60 C 40个 循环。常用的荧光基团是 FAM , TET , VIC ,HEXI NUMFt Rr pmTF h a CfUEWHEHS I I 4i ii ilDE Wl.fiTaqinan加；i】作原F；(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡 核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标 记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基 团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬 灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是 可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中， 环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互 补 ;茎一般 5-7 个核苷酸

5、长，并相互配对形成茎 的结构。 荧光基团标记在探针的一端， 而淬灭剂 则标记在另一端。 在复性温度下， 因为模板不存 在时形成茎环结构， 当加热变性会互补配对的茎 环双链解开， 如果有模板存在环序列将与模板配 对。与模板配对后， 分子信标将成链状而非发夹 状，使得荧光基团与淬灭剂分开。 当荧光基团被 激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由 于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM , Texas Red 。PCR 扩 增程序通常是：945572 C三步法，40个 循环。Targe：十MolecularBeaconFluorophoreHybridQuencher分子

6、信标丁作原理FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由 两条相邻探针组成，在一条探针的5'端标记FAM荧光基团，另一探针的 3'端标记Red 640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上， FAM基团和Red640基团相邻，激发 FAM 产生的荧光，作为 Red640基团的激发光被吸 收，使Red640发出波长为640的荧光。当变 性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640 波长的荧光。由于 FRET探针是靠近发光，所 以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧 光基团是：LC-Red640，LC-Red705。DenaturaiiontPr>,rTir nr>u

7、probQ annodhng! "i'Tl 厂 * TTLPolyr>>er iSafiQHFRET工作原理能用于实时荧光PCR定量的方法很多，各 有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件 选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：SYER BEENFKET掇卄T<q>>n分于怡标性用可世黄7积留英光IB底分析平能引将1非特异性界引 *r+z ifift引物+棵H引 tt+mt转异性If成引物一案休有1輛）.探*1不需要需整1*3 乂需要专用督用专用实验中的一些好习惯：加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时 间长了浓度不均；移液枪用完之后要归到

8、最大计 量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记；多和大家讨 论，同时多关注别人讨论的经验， 这几乎是最快 提高的捷径了 ；所有的试剂都自己配，出了问题 才好找原因。防止RNA酶污染的措施：1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 C的 高温下干烤6h或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯 仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀， 故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤， 双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2室 温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在

9、37 C处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22 ym滤膜 过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实 验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应 为专用。常用的RNA酶抑制剂：1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）:是一种强烈但不彻 底的RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环结合使 蛋白质变性.从而抑 制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA酶失 活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离 出来，又对RNA

10、酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核 苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态 类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）:从大鼠肝 或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对 RNA酶 也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和 RNA， 因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且 它与一些缓冲液（例如Tri）不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得 到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖 核酸酶（RN

11、A酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、 高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污 染源是研究人员的手。因此进行 RNA实验时应 勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和 DTT的试剂不能用DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法：Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的 组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。 RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂 交， Poly(A)+ 分离，体外翻译， RNase 封阻分 析和分子克隆。1. 将组织在液 N 中磨成粉末后，

12、再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨，注意样 品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10% 。2. 研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧 离心管，用手剧烈摇荡离心管 15 秒。3. 取上层水相于一新的离心管，按每 ml Trizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇， 室 温放置 10 分钟， 12000g 离心 10 分钟。4. 弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4 C下 7500g 离心 5 分钟。5. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥

13、5-10 分钟，注意不要干燥过分， 否则会降低 RNA 的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55 C-60 C水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离, 或贮存于70%乙醇并保存于-70 C。注意1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可 能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀 的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污 染，影响比值2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 C保存一个月 以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一 周，-20 C保存一年。总mRNA的提取经验：一、 关于Trizol Reage nt 需要的试剂1. Chloroform :氯仿(分析纯)2. Iso

14、proplyl alcohol :异丙醇(分析纯)3. 75% Etha no l(in DEPC-treated water)75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用 0.01%的 DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4. RNase-free water :无 Rnase 的水。方法 是：将 DEPC 按 0.01%(V/V)加在 d H2O 中 500ml(50ul)，在37 °C过夜，并高压灭菌即得 (150 C 3 小时)5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPC有致癌之嫌二、关于Trizol Reage nt 的使用过程：1. Homoge ni zation（ 匀浆）a.

15、Tissues :组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品 体积不能超过Trizol试剂的10%。b. Cells Grow n in mo no layer（单层细胞接毒后出现病变的）针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用 大瓶）,37 C吸附1h，倒掉，加维持液（含 2%的 血清和HEPE8的MEM）约5ml ,维持天。出 现 75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两 次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂 1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有 两种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2， 故所用Tr

16、izol试剂分别约为4.5ml和3ml。 Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致 DNA 的污染 )具体方法如下： (样品一定要新鲜 )(1) 组织接入预冷的 EP 管中，加入 Trizol 试 剂 1ml/10cm2( 量一定要加足， 否则易污染 ) ，混 匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温 5min ，以 使核蛋白复合物彻底分离。(2) 加氯仿 0.2ml( 每 1ml Trizol 试剂加入氯 仿 0.2ml) ，盖好，剧烈震荡 15s ，置室温 2-3 分 钟。(3) 4 C离心，10000g xi5min，离心后，混合 物将分离为底层为

17、浅红的、中层为酚 -氯仿相、 上层为无色的水相。 RNA 包含在水相中，水相 的体积约相当于所加的 Trizol 试剂量的 60% 。(4) 仔细吸取上层水相，移至另一 EP 管中。(5) 加 0.5ml 异丙醇，以沉淀 RNA( 每 1ml Trizol 试剂加入 0.5ml 异丙醇 )，置室温 10min 。(6) 4 C离心，10000g XIOmin。RNA 沉淀为 一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。(7) 弃上清液，加入预冷的 75%乙醇 1ml( 每 1ml Trizol 试剂加入 75% 乙醇至少 1ml) ，震荡，充分洗涤沉淀，4°C离心，5500gX5min。弃

18、上 清液，空气干燥 (或真空干燥 )后，沉淀重悬于无Rnase dH20 中，吹吸几次，55 C -60 C作用10 分钟以溶解RNA , -70 C保存备用。(8) 抽提出的细胞总 RNA 干燥后加水 50ul ， 取 10ul 加无 Rnase 水 990ul ，稀释 100 倍成 1ml 。于 0.5cm 厚的石英比色杯中， 以无 Rnase 水为对照， 在 721 型紫外分光光度计下检测， 结 果应为： A260/280 ratio<1.6 。(9) 分离组织 10mg( 纯组织 )加 800ul Trizol 试剂。(10) 扩增产物的鉴定。DEPC 处理方法如下：1. DEP

19、C 处理：(1) DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC ，充分混匀，高压灭菌。(2) Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及 做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200卩1、 20卩l Tip头;EP管和PCR反应管等)：用0.1%的 DEPC 水 (1000 ml 超纯水加入 1mlDEPC)37 C浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取 RNA ，用 DEPC 水溶解。3. RT:我是用PCR仪来控制温度和时间的， 所以 RT 是在 PCR 反应管中作的。4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手 套。最好把要直接接触样品的东西都用 DEPC 水 处理一下，枪头盒插好枪头后

20、，加入 1-2ml 的 0.1%DEPC 水，在灭菌就行了 ;现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买，直接用不用处理的。如何消除污染:机器运行完后，取出 PCR 产物时不能随便丢 弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾 桶。(1) 试剂: mixer 尽量分装，不要原瓶多次取 用。(2)加样:原则是 DNA 最后加， 其他试剂按照 体积大小从大往小的加。 如果是同种引物和探针 有多管的话只是 DNA 不同，那么采取的方法是 算出总体积后加在一个管子里面， 混合均匀之后 再分装到各个管子里去， 这样可以有效地避免误 差及污染。另外，普通实验室容易污染，且污染程度很 高，与跑电泳还有质粒

21、制备提取都在同一个房间 里有比较大的关系， 最容易造成高浓度污染的就 是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大 多采用了 UNG 来防污染。 Uracil-DNA N-glycosylase(UNG) 尿嘧啶 DNA 糖基酶，来 源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA 定量：RNA 也最好至少要用电泳，一方面定量，另 一方面可以看看完整性。 至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。RNA 的贮藏，最主要的是温度， -20 不够， 最好 -80，液氮最保险。mRNA 是不能代替蛋白水平的分析的，因为 还有翻译效率和 RNA 降解速度的影响。RT-PCR 有两种做法：条件具

22、备的话可用 kit 进行一步法进行 ;若条 件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR 。两 步法的结果更加理想， 条带特异性强且无拖尾现 象，由此推测是体系更加单一比较利于 PCR 的 进行。一定要做内参的， 不作内参的结果是不可 信的。电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相 对表达程度，半定量和定量 RT-PCR 做的都是 基因相对表达量，不是绝对表达量 mRNA 的分 离与纯化中。步骤(4)中将RNA溶液置65 C中温育然后冷 却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏 RNA 的二级结构，尤其是 mRNA Poly(A+) 尾处 的二级结构，使 Poly(A+) 尾充分暴露，从而提 高 Po

23、ly(A+)RNA 的回收率 ;另一个目的是能解 离 mRNA 与 rRNA 的结 合，否则会导致 rRNA 的污染。所以此步骤不能省略。下面，我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有 没有残留的 RNA 酶的方法。保温试验：方法很简单的，按照样品浓度，从 RNA 溶液 中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的 离心管中，并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放 入70 C的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在 -20 C冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电 泳完成后， 比较两者的电泳条带。 如果两者的条 带一致或者无明显差别 （当然，它们的条带也要 符合方法 2 中的条件 ）， 则说明 RNA 溶液中没 有残留的 RNA 酶污染， RNA 的质量很好。 相反 的，如果70 C保温的样本有明显的降解，则说 明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。PCR 污染与对策：PCR 扩增产物污染 .这是 PCR 反应中最主要 最常见的污染问题， 所以，扩增区的仪器什么如 枪头等要注意。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污 染的形式是气溶胶污染 ;在空气与液体面摩擦时 就可形成气溶胶，