《双向凝胶电泳》ppt课件

1、第五章第五章 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2D-PAGE)蛋白质组分析的技术道路蛋白质组分析的技术道路双向凝胶电泳技术的开展及原理双向凝胶电泳技术的开展及原理仪器简介仪器简介样品制备样品制备技术流程技术流程1. 蛋白质组分析的技术道路蛋白质组分析的技术道路要求要求流程流程技术道路技术道路蛋白质组分析的首要要求蛋白质组分析的首要要求未来自于全细胞、组织或生物体中所包未来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进展分别、检测含的多达几千种混合蛋白质进展分别、检测和分析和分析 。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋

2、白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分别电泳分别图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋蛋白白质质组组分分析析流流程程蛋白质组研讨的根本技术道路蛋白质组研讨的根本技术道路蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液

3、中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或知蛋白新的或知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定2. 双向电泳技术的开展及原理双向电泳技术的开展及原理双向凝胶电泳的开展双向凝胶电泳的开展 双向凝胶电泳的根本原理双向凝胶电泳的根本原理 双向凝胶电泳的开展双向凝胶电泳的开展双向凝胶电泳的思绪最早是由双向凝胶电泳的思绪最早是由Smithies 和和Poulik提出提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum prote

4、ins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自在溶液迁移率，蛋白质第一向电泳是根据其自在溶液迁移率 (free-solution mobility)，在滤纸条上进展；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进展。在滤纸条上进展；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进展。随后，随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:

5、711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，这即是双向凝胶电泳这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE

6、)。同年，同年，2D PAGE在原理上又有了新的开展，以第一向为蛋白质等电聚焦在原理上又有了新的开展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combine

7、d elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seylers Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。20世纪世纪70年代初，在第二向电泳中又运用了十二烷基磺酸钠年代初，在第二向电泳中又运用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165

8、-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳根本上根据蛋白质的相对分子质量来分别，从而奠定了，使第二向电泳根本上根据蛋白质

9、的相对分子质量来分别，从而奠定了现代双向凝胶电泳的根底，即现代双向凝胶电泳的根底，即IEF-SDS PAGE。1975年，年，OFarrell、Klose和和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (OFarrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klose J. protein mapping by combined isoele

10、ctric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。此项技术是目前独一能将数千种蛋白质同时分别并展现的分别技术，普此项技术是目前独一能将数千种蛋白质同时分别

11、并展现的分别技术，普通能分别通能分别1000 3000个蛋白质点，最好的胶能分别得到个蛋白质点，最好的胶能分别得到11000个左右的蛋白质个左右的蛋白质点。点。双向凝胶电泳的根本原理双向凝胶电泳的根本原理先将蛋白质根据其等电点在先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进展等电聚焦，然后按照它们的梯度胶内进展等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进展相对分子质量大小进展 SDS-PAGE 第二次电泳分别。第二次电泳分别。第一向进展等电聚焦第一向进展等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至和等

12、电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进展电泳时，会向与其所梯度介质上进展电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向挪动。挪动过程中，蛋白分子能够获得或失去质子，并带电荷相反的电极方向挪动。挪动过程中，蛋白分子能够获得或失去质子，并随着挪动的进展，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电随着挪动的进展，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再挪动。当蛋白分散到低于其等位置时，其净电荷数为零，在电场中不再挪动。当蛋白分散到低于其等电点电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极挪动。同样，假设蛋区域时，带正电荷，在

13、电场的影响下重新向阴极挪动。同样，假设蛋白质分散到高于其等电点的白质分散到高于其等电点的 pH 区域时，那么带负电，在电场的作用下会向阳区域时，那么带负电，在电场的作用下会向阳极挪动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的极挪动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介梯度介质区域内。目前常运用预制胶条质区域内。目前常运用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的用于蛋白质的等电聚焦分别，将聚焦好的等电聚焦分别，将聚焦好的 IPG 胶条在含有胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。的缓冲液中平衡。第二向是将在第二向是将在

14、IPG 胶条中经过第一向分别的蛋白质转移到胶条中经过第一向分别的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分别。沿大小与第一向相垂直的分别。沿垂直的方向进展垂直的方向进展 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进展分别。样品经过电荷和电泳，按分子量大小进展分别。样品经过电荷和质量两次分别后，得到等电点和分子量的信息。质量两次分别后，得到等电点和分子量的信息。 IPG 胶的资料是胶的资料是 Immobilines，为拥有，为拥有CH2=CH-CO-NH-R构造的构造的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中种丙烯酰胺衍

15、生物系列，其中R包含羧包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 310不同值的不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团经过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而构成经过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而构成pH梯度。经过这种方式生成的梯度。经过这种方式生成的IPG不会发生电浸透作用，不会发生电浸透作用，因此可以进展特别稳定的因此可以进展特别稳定的IEF分别到达真正的平衡形分别到达真正的平衡形状。状。三种双向凝胶等电聚焦系

16、统三种双向凝胶等电聚焦系统根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：统：ISO-DALT、NEPHGE和和IPG-DALT。在在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶 (tube gel) 中进展，载中进展，载体两性电解质体两性电解质 (carrier ampholyte) 在外加电场的作用下构成在外加电场的作用下构成pH梯度，梯度，pH梯度梯度在碱性区不稳定阴极漂移、反复性不易掌握和上样量低是其主要缺陷，在碱性区不稳定阴极漂移、反复性不易掌握和上样量低是其主要缺陷，

17、并且普通不能分别等电点大于并且普通不能分别等电点大于8.0的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展任务，各种电泳条件经优化后，可到达非常高电泳溶液容易配制，易于开展任务，各种电泳条件经优化后，可到达非常高的分辨率，也可获得好的反复性，目前独一分辨到的分辨率，也可获得好的反复性，目前独一分辨到10000个蛋白质斑点的图谱个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。正是采用了这一系统。NEPHGE为非平衡为非平衡pH梯度电泳梯度电泳 (nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是，是IPG (

18、immobilized pH gradient) 胶发明前用于分别碱性蛋胶发明前用于分别碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中到达平衡前终了电泳，第一向的白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中到达平衡前终了电泳，第一向的pH也是依托载体两性电解质和电场来建立。也是依托载体两性电解质和电场来建立。IPG-DALT的第一向电泳是采用的第一向电泳是采用1982年发明的年发明的IPG胶胶 (Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradient: principle, methodo

19、logy and some applications. J Biochem Biophys Methods, 1982, 6: 317-339)，其，其pH梯度的构成依赖于不同梯度的构成依赖于不同pK值的一种合成的化合物值的一种合成的化合物immobiline，该，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，IPG胶的胶的pH梯度是稳定的，不依赖于外加梯度是稳定的，不依赖于外加电场，根本上抑制了电场，根本上抑制了ISO-DALT的主要缺陷，无论在

20、反复性和上样量上均优的主要缺陷，无论在反复性和上样量上均优于于ISO-DALT。非变性非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进展，这样分别的蛋：两向均在非变性条件下进展，这样分别的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；值是一样的；非变性非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性：第一向采用非变性IEF，之后在，之后在2% SDS溶液中平衡；第二向也在溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进展。适于分析存在的条件下进展。适于分析非共价键衔接的蛋白非共价键衔接的蛋白-蛋白间的相互作用。蛋白间的相互作用。

21、非变性非变性/复原复原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下：非变性条件下IEF聚焦，之后用聚焦，之后用8M尿素尿素 + 5%-ME + 2%SDS进展平衡，再进展第二向进展平衡，再进展第二向SDS-PAGE电泳。此时分别的蛋白质点可进展点的切取、蛋白酶消电泳。此时分别的蛋白质点可进展点的切取、蛋白酶消化、化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键衔接的多分析鉴定，提供关于断裂二硫键衔接的多肽的信息。肽的信息。变性变性2D-PAGE：样品先用：样品先用2%SDS + 5%-ME + 95变性变性5min, IEF在在8M尿素尿素 + 1%NP-40条件下进展，之后胶条用条件下进展

22、，之后胶条用2%SDS + 5%-ME平衡，然后进展平衡，然后进展SDS-PAGE。该技术适于。该技术适于DNA序列和序列和多肽构造的分析，或分析被碳氢键衔接和其它翻译后修饰所引多肽构造的分析，或分析被碳氢键衔接和其它翻译后修饰所引起的多肽构造微异质性，但此方式显示的大于起的多肽构造微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质的蛋白质点少于第三种方式。点少于第三种方式。双向电泳的分类双向电泳的分类3. 仪器简介仪器简介第一向：第一向：采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为为10, 000伏；有不同的电压上升方式；可分步伏；有不同的电压上升方式；可分步进展时

23、间或电压进展时间或电压小时控制；重泡胀可采取整体小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦焦24根根7cm，12根根17cm胶条；有三个预设程序胶条；有三个预设程序的方法；有十个用户自定方法；采集运转数据的方法；有十个用户自定方法；采集运转数据可经可经RS232端口输出或任何热敏打印纸。端口输出或任何热敏打印纸。BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF Cell 等电聚焦仪：等电聚焦仪：Amersham pharmcia Biotech公司公司IPGphor等电聚焦仪：等电聚焦仪：电极区域为铜镀金板；最多上电极区域为铜镀金板

24、；最多上12个样品；平台温度为个样品；平台温度为18-251；胶；胶条槽条槽 (Holder) 体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适宜体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适宜7、11、13和和18cm的胶的胶条；程序参数包括重泡胀时间、平台温度、每根胶条的最大限流、每步的电条；程序参数包括重泡胀时间、平台温度、每根胶条的最大限流、每步的电压、每步的电流改动方式、每步的时间；可编辑压、每步的电流改动方式、每步的时间；可编辑10个程序，每个程序分有九个程序，每个程序分有九个步骤；电压输出最大为个步骤；电压输出最大为8000V；最大电流为；最大电流为1.5mA；最大功率为；最大功率为12W。第二向：第二向：

25、BIO-RAD公司公司PROTEAN II xi Cell电泳槽：电泳槽： 电极是直径为电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于英寸的白金电极；适用于16.520cm 凝胶电泳；凝胶凝胶电泳；凝胶厚度为厚度为1.0mm；可同时运转；可同时运转1-2块胶；上槽缓冲溶液块胶；上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液，下槽缓冲溶液1.2 L；典型；典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为电泳时间：无冷却时为5小时，带冷却时为小时，带冷却时为3.5小时。配套小时。配套电源为电源为Power Pac 1000：在进展电泳时，最大电压不超越：在进展电泳时，最大电压不超越1000V，最大功率不，最大功率不超越

26、超越80W，最大室温不超越，最大室温不超越50。 Amersham pharmcia Biotech公司公司Ettan DALT II System： (1) 此系统的电源控制为此系统的电源控制为Power Supply/Control Unit：最大输出功率是：最大输出功率是200W；温度控制范围是；温度控制范围是10-50最大电压最大电压600V；最大电流；最大电流1A。(2) 运用运用Gel caster灌胶模具：最多可同时灌灌胶模具：最多可同时灌25.520.5cm、1mm厚的梯度胶或均一胶厚的梯度胶或均一胶14块。块。Amersham pharmcia Biotech公司公司Hoef

27、et miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit：胶大小为胶大小为10.08cm ;最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需1.7L电极缓冲液，电极缓冲液，跑两块胶时需跑两块胶时需1.2L电极缓冲液；最大电压是电极缓冲液；最大电压是600V，最大功率是，最大功率是25W；所配置电；所配置电源为源为Electrophoresis Power Supply EPS 301。图像分析软件：图像分析软件： Amersham pharmcia Biotech公司：公司： imageMasterTM 2D version:5.0B

28、IO-RAD公司：公司： PDQuesTM4. 双向电泳分析中的样品制备双向电泳分析中的样品制备应使一切待分析的蛋白样品全部处于溶解形应使一切待分析的蛋白样品全部处于溶解形状包括多数疏水性蛋白，且制备方法应状包括多数疏水性蛋白，且制备方法应具有可重现性。具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰如酶性或化学性降解等。学修饰如酶性或化学性降解等。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，尽量去除起干扰

29、作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研讨蛋白的可检测性。从而保证待研讨蛋白的可检测性。样品的分级处置样品的分级处置经过采用亚细胞分级、液相电泳和选经过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进展分级处择性沉淀等方法对蛋白质样品进展分级处置，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋置，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处置是采用分级白质。当前最简单有效的处置是采用分级抽提，按样品溶解度不同进展分别。抽提，按样品溶解度不同进展分别。 样品的溶解样品的溶解是是2-DE胜利分别蛋白质的最关键要素之一。胜利分别蛋白质的最关键要素之一。1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全

30、破坏，从、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而构成各个多肽的溶解液否那么样品中结合结实的蛋白而构成各个多肽的溶解液否那么样品中结合结实的蛋白复合物能够使复合物能够使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降；肽的点的强度会下降；2、溶解方法必需允答应能干扰、溶解方法必需允答应能干扰2-DE分别的盐、脂类、多糖和分别的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中坚持溶解形状。、溶解方法要保证样品在电泳过程中坚持溶解形状。溶解的目的：溶解的目的：添加样品溶解性的手段添加样品溶解性的手段变性

31、剂：经过改动溶液中的氢键构造使蛋白质充分伸展，将其疏变性剂：经过改动溶液中的氢键构造使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。是尿素和硫尿。外表活性剂：经过变性剂处置而暴露蛋白质的疏水基团后，还常外表活性剂：经过变性剂处置而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种外表活性剂来溶解疏水基团。常用的外表活性剂需至少一种外表活性剂来溶解疏水基团。常用的外表活性剂有离子去污剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂、非离子去污剂Triton X-100和和NP-40、两、两性离子去污剂性离子去污剂CHAPS、OB

32、G等。其中等。其中CHAPS和和SB3-10最好。最好。复原剂：在变性剂和外表活性剂联用条件下，加复原剂可使已变复原剂：在变性剂和外表活性剂联用条件下，加复原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自在巯基的性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自在巯基的DTT或或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦 (TBP) 进展进展复原。复原。起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和外表活性剂存在的情起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和外表活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需求在盐离子的作用下才干坚持其处于况下，某些蛋白质也需求在盐离子的作用下才干坚持其处于溶解形

33、状，否那么这些蛋白质在其处于溶解形状，否那么这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。运用时，两性电解质的浓度应小于而保证蛋白质的溶解性。运用时，两性电解质的浓度应小于0.2(w/v)。浓度过高会使。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证的速度降低。另外，为了保证明验的准确性，在选择不同明验的准确性，在选择不同pH范围的范围的IPG胶条时，也应使两胶条时，也应使两性电解质的性电解质的pH值与之相符合。值与之相符合。样品中核酸的去除样品中核酸的去除对电泳

34、的影响：添加样品粘度、与蛋白质构对电泳的影响：添加样品粘度、与蛋白质构成复合物后会出现假象迁移和条纹。成复合物后会出现假象迁移和条纹。处理方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内处理方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进展降解，或是利用合成载体两性电解切酶进展降解，或是利用合成载体两性电解质质 (SCA) 同核酸结合构成复合物的才干，再同核酸结合构成复合物的才干，再经过超速离心来去除复合物。经过超速离心来去除复合物。 亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分别出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适用超离心技术分别出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进展溶解。其优点是不仅

35、大大减少样品的当的蛋白质溶解液进展溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分别的蛋白质进展亚细胞定位。但该法需复杂性，而且可对分别的蛋白质进展亚细胞定位。但该法需求专业仪器，有时会出现假阳性。求专业仪器，有时会出现假阳性。第一步：用第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用规范用规范IEF样品液溶解提取高疏水样品液溶解提取高疏水性蛋白；性蛋白；第三步：用含复合外表活性剂的蛋白溶解液，最后抽提早两第三步：用含复合外表活性剂的蛋白溶解液，最后抽提早两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的次抽提后不能溶

36、解的膜蛋白约占整个样品的11%W/W。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差别，器具有顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差别，器具有不同溶解才干的蛋白溶解液进展抽提不同溶解才干的蛋白溶解液进展抽提的方法。的方法。特殊样品的制备特殊样品的制备低丰度蛋白的分别：虽然添加上样量和提高总蛋白的溶解度能添低丰度蛋白的分别：虽然添加上样量和提高总蛋白的溶解度能添加分别时的低丰度蛋白的量加分别时的低丰度蛋白的量, 但同时添加了高丰度蛋白的负荷，但同时添加了高丰度蛋白的负荷，且呵斥蛋白的叠加效应而影响分别。现常用预分级窄且呵斥蛋白的叠加效应而影响分别。现常用预分级窄pH胶胶的微制备技术进展分别：即将总蛋白组分成蛋白

37、质组亚群，的微制备技术进展分别：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用再用pH梯度小于梯度小于2个个pH单位的单位的IPG胶进展窄胶进展窄pH范围的分别。范围的分别。 强碱性蛋白质如核糖体的处置：先将蛋白预处置以富集，再强碱性蛋白质如核糖体的处置：先将蛋白预处置以富集，再用特殊用特殊pH梯度的梯度的IPG胶条如胶条如pH3-12、4-12或或10-12) 进展等进展等电聚焦。其中窄范围碱性电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶如胶如pH10-12) 的挑战是抑制的挑战是抑制反向、阴极向阳极、电渗流和程度条纹方式，而宽范围的碱反向、阴极向阳极、电渗流和程度条纹方式，而宽范围的碱性性IPG胶如胶如pH3-12

38、、4-12) 等消除了窄范围胶所需求的专门等消除了窄范围胶所需求的专门水化液。水化液。极端分子量的蛋白质：小于极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于和大于200kD的蛋白在常规的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这能够是在上不易看到，这能够是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游缓冲液中，样品和游离的离的dodelcyl sulfate ions继续积累浓缩，与小分子量的蛋白继续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染白的分辨率；在胶底端，高浓度的十

39、二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的缘由能够是在变性条件下，色困难。至于高分子量蛋白少的缘由能够是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者能够是大分子。蛋白质复合物变成了多肽，或者能够是大分子。5. 双向凝胶电泳技术流程双向凝胶电泳技术流程IPG重泡涨及样品加样重泡涨及样品加样第一向等电聚焦第一向等电聚焦第二向第二向SDS-PAGE检测检测问题及处理方法问题及处理方法IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀重泡涨时间至少要重泡涨时间至少要10h，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关阐

40、明书。重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关阐明书。不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差别。不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差别。温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度普通稳定在温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度普通稳定在20，太低尿素会结晶出，太低尿素会结晶出来，温度不稳也会呵斥胶上的蛋白质点位置的变化。来，温度不稳也会呵斥胶上的蛋白质点位置的变化。重泡涨时加上重泡涨时加上30-50V的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备型电泳时才有意义。型电泳时才有意义。商品化的胶条运用前是以干胶条的方式和塑料支撑薄膜粘在一同，加

41、样前商品化的胶条运用前是以干胶条的方式和塑料支撑薄膜粘在一同，加样前需求先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：需求先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG Buffer, 痕量痕量Bromophenol Blue，和裂解，和裂解液成分根本一样，在液成分根本一样，在10-100mmol/L浓度范围内适当提高浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度。蛋白质的检测灵敏度。重泡涨可在等电聚焦盘内进展，此时样品曾经加到重泡涨液中，在加样杯重泡涨可在等电聚焦盘内进展，此时样品曾经

42、加到重泡涨液中，在加样杯上样上样 (cup loading) 方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。电聚焦盘内加样。泡胀的本质：是让样品能完全以可溶性的方式进入泡胀的本质：是让样品能完全以可溶性的方式进入IPG内，从而能进展接下内，从而能进展接下来的来的IEF。 加样加样样品可以在重泡涨时参与，称为胶内重泡涨样品可以在重泡涨时参与，称为胶内重泡涨 (in-gel rehydration)，也可以重泡涨完成后再参与，如加样杯上样。重，也可以重泡涨完成后再参与，如加样杯上样。重泡加样相对不可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶

43、和样品泡加样相对不可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和样品的界面产生沉淀，然而在某些特殊情况下，重泡涨后加样具有的界面产生沉淀，然而在某些特殊情况下，重泡涨后加样具有优势，如运用优势，如运用 pH 6-9 的胶条分别碱性蛋白质时，在阳极用加样的胶条分别碱性蛋白质时，在阳极用加样杯加样，可以得到更好的图谱。普通而言，胶内重泡涨是引荐杯加样，可以得到更好的图谱。普通而言，胶内重泡涨是引荐方式，可以添加蛋白质的上样量，也防止了在阴极或阳极加样方式，可以添加蛋白质的上样量，也防止了在阴极或阳极加样的方向问题。的方向问题。分析型双向凝胶电泳上样量在几十至几百微克之间，制备型双分析型双向凝胶电泳上样量在

44、几十至几百微克之间，制备型双向凝胶电泳上样量在数百银染到最大几十毫克考马斯亮向凝胶电泳上样量在数百银染到最大几十毫克考马斯亮蓝染色之间，上样量的大小和胶条的蓝染色之间，上样量的大小和胶条的pH范围也有关系，范围也有关系，pH 范围越窄，上样量月大。但由于蛋白质定量方法的反复性并不范围越窄，上样量月大。但由于蛋白质定量方法的反复性并不非常可靠，最正确的上样量要根据实验结果来优化。非常可靠，最正确的上样量要根据实验结果来优化。蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的要素包括：胶条对蛋白载样量的要素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳

45、的目的：假设只是得到一张好的图片，那么无需电泳的目的：假设只是得到一张好的图片，那么无需思索太多其它要素。思索太多其它要素。待研讨蛋白的丰度：待研讨蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽能够的了样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽能够的了解所包含的每种蛋白，需求反复实验才干完成。假解所包含的每种蛋白，需求反复实验才干完成。假设将待检样品被富集以后那么更易分析。设将待检样品被富集以后那么更易分析。IPG胶条的胶条的pH范围：范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Prep

46、arative Load(Coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中 pH梯度的选择梯度的选择 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预实验确定。预分步预分步搜集搜集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH 3-4pH 4-5pH 5-6pH 6-7

47、pH 7-8pH 8-9pH 9-10pH 10-11pH 11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分别范围阵列分别低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列战略的框架图亚蛋白质组阵列战略的框架图3倍3倍聚焦时间的优化聚焦时间的优化 重泡涨终了后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以重泡涨终了后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分。在阴极加上吸收盐离子和补充水分。在阴极加上20mmol/L DTT润湿的纸润湿的纸片可减少碱性端的程度条纹并且有助于碱性蛋白质的聚

48、焦。片可减少碱性端的程度条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。从实际上讲，获得最好的图谱质量和反复性所需的最正确时间从实际上讲，获得最好的图谱质量和反复性所需的最正确时间是是IEF分别到达稳定态所需的时间。分别到达稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致程度和垂直条纹的出现。聚焦时间太短，会导致程度和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会由于活性水转过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会由于活性水转运而导致过多水在运而导致过多水在IPG胶外表渗出电渗而呵斥蛋白图谱变胶外表渗出电渗而呵斥蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生程度条纹以及蛋白丧失。性，在胶条碱性端产生程度条纹以及蛋白丧失。

49、最正确时间确实定需求根据不同蛋白样品、上样量、最正确时间确实定需求根据不同蛋白样品、上样量、pH范围范围和胶条长度经过阅历来确定。和胶条长度经过阅历来确定。等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，去出胶条中的过多的盐离子；然后开场加高电压，电压上升的去出胶条中的过多的盐离子；然后开场加高电压，电压上升的方式为缓慢上升；最后是继续高压，电压上升的方式为快速上方式为缓慢上升；最后是继续高压，电压上升的方式为快速上升。普通原那么是：根据胶条的升。普通原那么是：根据胶条的pH范围和上样量的多少，总范围和上样量的多少，总电压时间积可

50、以在一定的范围内调整。电压时间积可以在一定的范围内调整。IEF的根本条件的根本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-

51、hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡 一维等点聚焦电泳终了后可马上进展二维电泳，一维等点聚焦电泳终了后可马上进展二维电泳，也可保管在两片塑料膜间于也可保管在两片塑料膜间于80保管数月。保管数月。但在二维电泳前一定要进展胶条的平衡，以便于被但在二维电泳前一定要进展胶条的平衡，以便于被分别的蛋白质与分别的蛋白质与SDS完好结合，从而在完好结合，从而在SDS-PAGE 时电泳能顺利进展。时电泳能顺利进展。建议方案是：用含建议方案是：用含2% (m/v) SDS、1% (m/v) DTT、6 mM尿素和尿素和30%甘油的甘

52、油的50mM Tris (pH8.8) 缓冲液缓冲液先平衡先平衡15min，再用，再用5% (m/v) 碘乙酰胺取代碘乙酰胺取代DTT后后的上述缓冲液平衡的上述缓冲液平衡15 min。假设用。假设用TBP替代替代DTT那那么只需一步平衡。么只需一步平衡。 二维二维 SDS-PAGE同普通同普通SDS-PAGE类似。类似。但普通在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把但普通在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把 IPG 胶条看作是紧缩胶，由胶条看作是紧缩胶，由于在于在 IPG 胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以以为非限制性胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以以为非限制性 IEF 胶低浓胶低浓度丙烯酰胺胶充任了浓

53、缩胶，所以只需运用分别胶也可运用紧缩胶。度丙烯酰胺胶充任了浓缩胶，所以只需运用分别胶也可运用紧缩胶。IPG 胶条平衡好后，普通将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以胶条平衡好后，普通将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以清洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板清洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板推到推到SDS-PAGE胶上端。胶上端。IPG胶条转移到胶条转移到SDS-PAGE有两种方式：一种方式是先将有两种方式：一种方式是先将IPG胶条放到胶条放到SDS-PAGE胶上，再参与熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先参与熔化的琼脂糖胶上，再参与

54、熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先参与熔化的琼脂糖溶液，再将溶液，再将 IPG 胶条放到胶条放到 SDS-PAGE 胶胶 上。两种方法各有优劣，第一种方上。两种方法各有优劣，第一种方式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好地处理了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入地处理了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入 IPG 胶时有时会呵胶时有时会呵斥图谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常引荐第一种方式。斥图谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常引荐第一种方式。SDS-PAGE胶的浓度需根据

55、研讨目的和样品性质而定。常用的是胶的浓度需根据研讨目的和样品性质而定。常用的是12%和和12.5 %的均一胶，灌胶方便，反复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较的均一胶，灌胶方便，反复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较为聚集，分别不佳。如采用为聚集，分别不佳。如采用9-16%的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白质点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。质点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。电泳过程中温度普通控制在电泳过程中温度普通控制在10-15。聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的理想显色剂

56、的7S平安平安 (safety)；灵敏灵敏 (sensitivity)；简单简单 (simplicity)；特异性特异性 (specificity)；快速快速 (speed)；稳定稳定 (stability)；兼容性兼容性 (synergy)。有机染料和银染有机染料和银染考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进展修饰而影响质谱分析的结果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺陷是：对某些种类的

57、蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析呵斥影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。 负负 染染能专门提高 PAGE 胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快 (515min)，蛋白质的生物活性能坚持：一旦用络合剂如 EDTA 或 Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进展提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完好蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的运用。胶体分散染料胶体分散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银

58、染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是曾经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进展一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用规范的实验室300nm紫外透射仪进展照像保管，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中经过SAGE所获得的基因表达程度的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进展免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。金属螯合染料金属螯

59、合染料这是一类与现代蛋白质组学研讨相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台 (包括自动化凝胶染色仪、图像分析任务站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解任务站和质谱仪等) 相结合。其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。凝胶的图像处置和分析凝胶的图像处置和分析典型流程：典型流程：凝胶图像的扫描；凝胶图像的扫描；图像加工；图像加工；斑点检测和定量；斑点检测和定量；凝胶配比；凝胶配比；数据分析；数据分析；数据呈递和解释；数据呈递和解释；2-DE数据库的建立。数据库的建立。2D-PAGE问题

60、与缘由问题与缘由第一向等电聚焦的问题第一向等电聚焦的问题问题与现象问题与现象可能原因与解决措施可能原因与解决措施IPG胶条在靠近胶条在靠近电极附近烧焦电极附近烧焦电流限制太高，最大电流限制设为电流限制太高，最大电流限制设为50A；IPG胶条没有完全重泡涨；胶条没有完全重泡涨；应检查重泡涨液的体积，保证重泡涨液的体积足够；应检查重泡涨液的体积，保证重泡涨液的体积足够；IPG胶条过于干燥；重泡涨和等电聚焦时加矿物油。胶条过于干燥；重泡涨和等电聚焦时加矿物油。电压太低，达不电压太低，达不到最高电压到最高电压样品盐浓度太高；样品盐浓度太高；脱盐或稀释样品，等电聚焦脱盐或稀释样品，等电聚焦12h后更换电