基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成从从基因文库基因文库中获取目的基因

2、中获取目的基因基因文库基因文库 基因组基因组文库文库cDNAcDNA文库文库基因文库的构建过程基因文库的构建过程限制酶限制酶拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增 将含有某种生将含有某种生物不同基因的许物不同基因的许多多DNADNA片断片断, ,导入导入到到中中, ,各个受体菌各个受体菌分别含有这种生分别含有这种生物的不同基因物的不同基因, ,称为称为基因文库基因文库。基因组文库基因组文库 cDNA文库的构文库的构建建-反转录法：反转录法： 以目的基因转录以目的基因转录成的成的信使信使RNARNA为模板，为模板，逆转录逆转录成互补的单链成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用

3、，然后在酶的作用下合成下合成双链双链DNADNA，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。提取生物某发育时期的提取生物某发育时期的mRNAmRNA单单 链链DNADNA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链CDNACDNA( (只含该生物部分基因只含该生物部分基因) )与载体连接导入到受体菌群储存与载体连接导入到受体菌群储存依据依据-目的基因的有关信息。目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。文库类型文库类型CDN

4、ACDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中基因中启动子启动子（具有启动作用的（具有启动作用的DNADNA片段）片段）无无有有基因中基因中内含子内含子（位于编码蛋白质序列内的（位于编码蛋白质序列内的非编码非编码DNADNA片段）片段）无无有有基因多少基因多少某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因物种间的基因交流物种间的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码

5、区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段位于基因首端一段, ,能与能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合合成的特殊成的特殊DNADNA序列。没有启动子，基因就不能转录。序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻碍片断，它能阻碍RNARNA聚聚合酶的移动，并使其从合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启

6、动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. .( (以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚酶聚酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子不能转录为信使子，内含子不能转录为信使RNA RNA 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 目的基因的目的

7、基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )cDNA文库文库为什么为什么cDNAcDNA文库没有内含子和启动子？文库没有内含子和启动子？(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环

8、的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列（模板）已知基因的核苷酸序列（模板）四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）等酶）等模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度能量能量利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合

9、酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：循环循环变性变性退火退火延伸延伸(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成：若基因）人工合成：若基因_，核苷酸序列又，核苷酸序列又 _ _ ，则可用此法。，则可用此法。较小较小已知已知用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒目的基因目的基因用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建 核心核心将切下的目的基因片段插入质粒

10、的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之暴露出相同的黏性末端，再加入暴露出相同的黏性末端，再加入DN

11、ADNA连接酶连接酶2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建 核心核心同一种同一种目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊

12、的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体和目既用到限制酶切割载体和目的基因，又用到的基因，又用到DNADNA连

13、接酶将目的基因和载体连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注

14、射法显微注射法目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达CaCa+ +处理细胞处理细胞1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染易感染双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物，对大多数单，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细可以转移到受体细 胞，并整合到受体细胞染色体的胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。过程：过程：T

15、i质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2 2）基因枪法：单子叶植物常用）基因枪法：单子叶植物常用（3 3）花粉管通道法：抗虫棉）花粉管通道法：抗虫棉2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁

16、殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA分子分子4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功分子水平分子水平检测检测个体水平个体水平鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方

17、法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交 两种生物的互补的两种生物的互补的DNADNA单链能够在一定条件下结合成双链。单链能够在一定条件下结合成双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针与转基因生物的目的基因杂补配对进行。因此，当用探针与转基因生物的目的基因杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置能看到），则交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置能看到），则说明目的基因已经插入受体细胞的染色体说明目的基因已经插入受体细胞的染色体DNADNA中。中。DNAD

18、NA分子杂交原理：分子杂交原理：基因探针：基因探针：是一小段单链的是一小段单链的DNADNA或或RNA,RNA,带有放射性同位素标记，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链碱基互补配对并能与目的基因的一条链碱基互补配对归纳步骤检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因DNADNA与与DNA杂交杂交检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNADNADNA与与RNA杂交杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交抗原抗体杂交检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金芽孢杆菌中提取毒蛋白，检测抗

19、虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金芽孢杆菌中提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分离出相应的抗体，并用荧注入某种动物体内，从动物的血清中分离出相应的抗体，并用荧光标记该抗体，然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，光标记该抗体，然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，如出现杂交带，则表明抗虫基因已经在棉花细胞中表达。如出现杂交带，则表明抗虫基因已经在棉花细胞中表达。个体水平个体水平鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 抗虫棉的接种实验抗虫棉的接种实验（左为抗虫转基因棉，使虫体发育不正常）（左为抗虫转基因棉，使虫体发育不正常）基基因因工工程程的的基基本本

20、操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗

21、体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存

22、在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？思考与探究思考与探究（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基

23、因的编码序列（cDNAcDNA）。）。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上 抗四环素的基因，构建成一个表达载体。抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有 四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大 肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如 果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已珠蛋白基因已 进入其中。进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎 后从中提取后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。练习练习1 1：(2008(2