第二章酶的生产与分离纯化(2)

1、第二章第二章 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化(2学时，共4学时)主要内容主要内容 酶分离、纯化的评价酶的剂型与保存酶的分子结构与催化功能4 酶分离、纯化的评价酶分离、纯化的评价酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。基本概念基本概念1酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。1961年国际酶学会规定：l min催化lmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ，其它条件 (pH

2、、离子强度) 采用最适条件。重要酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 总体积 (mL) 或 = 酶活力 总质量 (g)比活力比活力 (Specific activity) ：比活力是指单位蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。比活力是酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。 回收率回收率 (Yield percent) ：回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。 提纯倍数提纯倍数

3、：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。酶纯化评价实例酶纯化评价实例 5 酶的剂型与保存酶的剂型与保存酶制剂通常有下列四种剂型：n液体酶制剂n固体粗酶制剂n纯酶制剂n固定化酶制剂（见书中第五章）5.1 液体酶制剂液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。5.2 固体粗酶制剂固体粗酶制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某

4、种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。5.3 纯酶制剂纯酶制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶， 酶的保存方法酶的保存方法(1) 温度。(2) pH与缓冲液。 (5) 为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂：n 底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。n 对巯基酶，可加入SH保

5、护剂。如二巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫苏糖醇)等。n 其他如Ca2+能保护淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl能稳定透明质酸酶。(3) 酶蛋白浓度。(4) 氧。6 酶的分子结构与催化功能酶的分子结构与催化功能6.1 酶分子组成酶分子组成1. 酶蛋白酶蛋白虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质。酶蛋白有三种组成形式：单体酶，仅有一个活性部位的多肽链构成的酶分子质量为1335 k Dalton，为数不多，且都是水解酶；寡聚酶，由若干相同或不同亚基结合而组成的酶，亚基一般无活性，必须相互结合才有活性，分子质量为35 k Dalton以上到数百万单位；多酶复合体，

6、指多种酶进行连续反应的体系。前一个反应产物为后一反应的底物。2. 辅基或辅酶辅基或辅酶仅有少部分酶是由单一蛋白质所组成，而大部分酶则为复合蛋白质，或称全酶，是由蛋白质部分(酶蛋白)和非蛋白质部分所组成，即酶蛋白本身无活性，需要在辅因子(Cofactor)存在下才有活性。有机辅因子可依其与酶蛋白结合的程度分为辅酶(Prosthetic enzyme)和辅基(Prosthetic group)。（1）铁）铁卟啉卟啉w铁卟啉是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等氧化酶的辅基。w氧化酶的铁卟啉的功能在于靠铁的价电子变化（Fe2+Fe3+）来传递电子，催化氧化还原反应。SCHH3CCH3HCNH3C

7、CHNCH2CH2COOHCH3HOOCH2CH2CNFe2+CHSCH3CHCH3NCH组苯丙赖苏精半胱谷亮半胱 苏赖谷图 3-1 铁卟啉与酶蛋白的连结方式（2）黄素核苷酸黄素核苷酸 (FMN和和FAD等等)w黄素核苷酸为维生素B12 (核黄素) 的衍生物，为黄素酶类 (如氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等) 的辅基。NNNHNH3CH3COOOH OHOOCH2-(CHOH)3-CH2O-P-O-P-O- CH2OHOOHNNNNNH2FMNFAD图 3-2 FMN与FAD的分子结构在酶的催化作用下，FMN和FAD的功能是传递氢(传递质子和电子2H2H+2e)，亦称氢载体而自成氧化还原体系，反应

8、主要表现在6,7二甲基异咯嗪基团中的第1位及第10位N原子的脱氢与加氢。其反应式如图33。7 NNNHNH3CH3COOR1234910568+2H-2HNHNNHHNH3CH3COOR图 3-3 FMN与FAD的氧化 - 还原体系氧化型(FMN或FAD)还原型FAD. H2）(FMN. H2 或（3）烟酰胺核苷酸烟酰胺核苷酸(NAD及及NADP)w烟酰胺核苷酸是许多脱氢酶 (如异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等) 的辅酶。主要有两种：烟酰胺腺膘呤二核苷酸 (NAD、辅酶) 和烟酸胺腺膘呤二核苷酸磷酸 (NADP、辅酶)。OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COH

9、N+CONH2OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COHN+OPO3H2OHCONH2NADNADP图 3-4 NAD与NADP的分子结构NAD及NADP在脱氢酶催化过程中参予传递氢的作用，其氧化还原作用体现在烟酰胺环的第4位碳原子上的加氢或脱氢。在中性环境中其氧化还原的反应式如图35。N+CONH2RH4NCONH2RH4H+ H+2H-2H氧化型还原型或：NAD(P)+2H-2HNAD(P)H+ H+图 3-5 NAD及NADP传递氢过程（4）硫辛酸硫辛酸(6，8 二硫辛酸二硫辛酸) w硫辛酸在生物体广泛存在，呈黄色。它与酶蛋白呈牢固的结合状态，水解后为自由态。存在氧

10、化型和还原型两种状态，其结构式如下：CH2 HSCH2HCHS(CH2)4COOHCH2SCH2HCS(CH2)4COOH氧化型还原型+2H-2H当两者互相转变时，起传递氢的作用。另外，在酮酸氧化脱羧反应中，还起传递酰基的作用。（5）泛醌泛醌 (辅酶辅酶Q，简写为，简写为UQ) w泛醌是生物体中广泛存在的一种醌类衍生物。它是呼吸链上的一个组成成分，其功能是传递氢和电子，在氧化磷酸化作用中起重要作用。其结构式为：OOH3COH3COCH3(CH2CHCCH3CH2)nH（6）辅酶）辅酶A (CoA) w辅酶A在脂肪代谢中极为重要，其分子结构中含有维生素B族的泛酸部分，此外，尚含有腺嘌呤核苷酸和氨

11、基乙硫醇部分。OONNNNNH2H2COHPOOHOPOOHOOPHOOOHCH2CCH3CH3COHHCONHCH2CH2CONHCH2SH辅酶A图 3-6 辅酶A的结构式辅酶A也可写为CoASH。CoASH通过其巯基 (SH) 的受酰基与脱酰基，参与转酰基作用，其反应式为：CH3C-AOHAH-酶CH3C酶OCH3C酶OCH3C酶OCH3CSCoAOCoASHB上式A为酰基的供体；B为酰基的受体。乙酰辅酶A(CH3COSCoA)的硫酯键为一种高能键，当脱酰基时可放出大量的自由能，供给合成反应的需要，在酰化时则需要能量，因此，在酰化与脱酰过程中有能量的转移。脂肪酸的分解与合成也必须在酯酰辅酶

12、A的参与下才能进行，所以，辅酶A在脂肪代谢上非常重要。磷磷酸腺苷及其它核苷酸类酸腺苷及其它核苷酸类 在代谢过程中起着重要作用，它们是许多转磷酸基酶 (如磷酸激酶) 的辅酶。焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素(TPP) 酮酸脱羧酶和糖类的转酮酶(催化自酮糖上转2单位至醛糖上去的酶)的辅酶。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 氨基酸的转氨酶、消旋酶和脱羧酶的辅酶，磷酸吡哆胺与转氨作用有关。生物素生物素(维生素维生素H) 羧化酶的辅基，属于维生素族，它与酶蛋白结合后可催化CO2的掺入与转移。四氢叶酸四氢叶酸(辅酶辅酶F，THFA) 甲酰基、亚甲基等一碳基的载体，能参与一碳化合物的代谢。金属金属 除卟

13、啉环含铁或铜离子外，还有许多酶尚含有铜、镁、锌、钴等金属离子作为辅基，为酶的催化作用中不可缺少的组分。基本概念基本概念 2酶分子修饰：n通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。如金属离子交换法、 大分子修饰法n例如，Bender和Kosland成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。重要6.2 酶的结构与功能酶的结构与功能酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法化学法化学法又可分为：金属离子置换法、大分子修饰法、肽链有限水解法、蛋白侧链基团的小分子修饰法等。

14、生物法生物法是通过基因工程的手段改变蛋白质，即基于核酸水平对蛋白质进行改造，利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学结构更为合理的蛋白质。物理修饰法物理修饰法的特点是不改变酶的组成和基团，酶分子的共价键不发生变化。重要酶原：酶原：n酶是在活细胞中合成的，但不是所有新合成的酶都具有催化活力，这种新合成酶的前体 (无催化活力) 称为酶原 (Proenzyme) 。n就生命现象而言，酶原是酶结构一种潜在的存在形式，如果没有这种形式，生命就会停止。重要酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个

15、特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下 酶原激活的机理酶原激活的机理例如，哺乳动物的胰脏分泌到消化系绕中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每种酶原都是由二硫键交联的单一多肽链组成，它们在到达十二指肠以前，一直是十分稳定的，而到达十二指肠后则被另一种蛋白质水解酶所活化，这种活化过程是从无活力酶原转变成有活力酶的过程。该种酶原往往由该种酶所激活，称为酶原的自我激活。酶的多形性与同工酶n1975年H. Harris提出酶的多形性概念，认为很多酶可催化相同的反应，但其结构和物理化学性质有所不同，这种现象称为酶的多形性。根据 其 来 源 可 分 为 异 源 同 工 酶 和 同 工 酶 (Isoenzyme) ，前者是不同来源的同工酶.重要n例如，酵母菌中醇脱氢酶和动物肝脏中的醇脱氢酶，而后者是指来自同一生物体同一生活细胞的酶，能催化同一反应，但由于结构基因不同，因而酶的一级结构、物理化学性质以及其它性质有所差别，称为同工酶。测定同工酶最常用的方法是电泳法，此法对样品纯度要求不严格，分辨力强，而且简便快速。n例如天冬氨酸激酶 (AK) 有三种同工酶：AK1、AK2、AK3，