第五章固相析出分离法

1、固相析出分离法第五章第五章 固相析出分离法固相析出分离法结晶法结晶法（晶体）（晶体）沉淀法沉淀法（无定形固体）（无定形固体）固相析出分离法：固相析出分离法： 改变溶液条件，使溶质以改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。固体形式从溶液中分出的操作技术。盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法其他沉淀法固相析出分离法固相析出分离法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法其他沉淀方法其他沉淀方法结晶法结晶法等电点沉淀法等电点沉淀法成盐沉淀法成盐沉淀法表面活性剂沉淀法表面活性剂沉淀法高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法亲和沉淀法亲和沉淀法第一节第一节 盐析法盐析法一、基本原理一、基本原理 盐析

2、法是利用各种生物分子在盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液浓盐溶液中中溶溶解度的差异解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的，通过向溶液中引入一定数量的中性中性盐盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。到纯化目的的方法。 蛋白质溶液蛋白质溶液加入中性盐加入中性盐低盐，低盐，盐溶盐溶高盐，高盐，盐析盐析两性电解质，静电力作用，相互排斥；形成水化膜，避免相互碰撞。（1）生物大分子在水溶液中的特性（2）作用原理 破坏水化膜破坏水化膜 中和电荷中和电荷（3）盐析过）盐析过程程蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系

3、 Cohn经验公式：经验公式： lgS = - Ks S 蛋白质溶解度，蛋白质溶解度，g / L； 盐离子强度，盐离子强度， = ci Zi 2， ci 盐离子强度，盐离子强度，mol / L； Z i i 离子化合价；离子化合价； 常数；常数； Ks 盐析常数。盐析常数。Ks盐析法（盐析法（溶解度剧烈下降溶解度剧烈下降） 在一定的在一定的pH和温度下，和温度下，改变盐离子强度改变盐离子强度（浓度）（浓度）进行盐析进行盐析 分辨率不高分辨率不高 用于提取液的前期分离用于提取液的前期分离盐析法（盐析法（溶解度变化缓慢溶解度变化缓慢） 一定的盐离子强度下，一定的盐离子强度下，改变改变pH和温度和温

4、度进行盐析进行盐析 分辨率比分辨率比Ks盐析法高盐析法高 用于后期分离用于后期分离二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素无机盐种类无机盐种类溶质（蛋白质等）种类溶质（蛋白质等）种类pHpH值值温度温度蛋白质浓度蛋白质浓度a a、盐析作用规律、盐析作用规律 半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子作用较弱（作用较弱（感胶离子序感胶离子序）。）。 阴离子阴离子：柠檬酸根酒石酸根：柠檬酸根酒石酸根SO42-F-IO3- H2PO4- CH3COO- Cl- ClO3-Br- NO3- ClO4- I- CNS-阳离子阳离子：Th4+Al 3+ H+Ba2+S

5、r2+ Ca2+ Cs+ Rb+NH4+K+ Na+Li+ 1）无机盐的种类）无机盐的种类一般高价阴离子盐析作用较好b b、用盐的参考要求、用盐的参考要求 盐析作用要强盐析作用要强 较大的溶解度，受温度影响小较大的溶解度，受温度影响小 必须是惰性的必须是惰性的 来源丰富、经济来源丰富、经济c c、硫酸铵特点、硫酸铵特点优点：优点：价廉，溶解度大价廉，溶解度大，随温度变化小，随温度变化小缺点：缺点：水解变酸；高水解变酸；高pHpH释氨，腐蚀；残留量对产品释氨，腐蚀；残留量对产品有影响。有影响。 硫酸铵使用注意事项: 1、硫酸铵中常含有少量的、硫酸铵中常含有少量的重金属离子重金属离子，对，对蛋白质

6、巯基有敏感作用，使用前用蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理处理. 2、高浓度的硫酸铵溶液一般、高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调左右），使用前也需要用氨水调节至所需节至所需PH。 3、硫酸铵、硫酸铵容易吸潮容易吸潮，计算饱和度需注意，计算饱和度需注意。 蛋白质种类不同（蛋白质种类不同（和和 Ks不同不同），）， 盐析沉淀所需的无机盐量也不同。盐析沉淀所需的无机盐量也不同。 先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。2 2）溶质（蛋白质等）种类）溶质（蛋白质等）种类3 3）蛋白质浓度的影响）蛋白质浓度的

7、影响一般常将蛋白质浓度控制在一般常将蛋白质浓度控制在23为宜。为宜。 适当稀释，适当稀释，可使盐析分可使盐析分布曲线互相布曲线互相重叠的两个重叠的两个蛋白质分级蛋白质分级沉淀沉淀。4 4）温度的影响）温度的影响n 一般在高盐浓度下，温度一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。升高，其溶解度反而下降。n 必须考虑到蛋白质对热稳必须考虑到蛋白质对热稳定性。定性。 - 淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白5）pH的影响的影响 影响蛋白质影响蛋白质表面净电表面净电荷荷的数量的数量。 通常调整体系通常调整体系pHpH值使值使其在其在pIpI附近；附近； 在高盐溶

8、液中蛋白质在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。等电点的偏移现象。 2120P1PPVaV 盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。1. 盐析用盐的浓度表示（1）加硫酸铵的饱和溶液）加硫酸铵的饱和溶液三、盐析操作Va：加入的饱和（NH4 )2S04 体积V0：蛋白质溶液原始体积P1、P2：分别表示初始和最终溶液的饱和度，（2 2）直接加固体硫酸铵）直接加固体硫酸铵212AP1)PG(PX在工业生产溶液体积较大时

9、，或需要达到较高的在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。为达到所需硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由下式计算而得：下式计算而得：X：1L溶液需加人固体（NH4 )2SO4 的质量（g)；G：饱和溶液中的盐含量，0时为515，20为513；A：常数，0时为0.27， 20为0.29。2.2.盐析方法和注意事项盐析方法和注意事项1）分级盐析法）分级盐析法注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致；注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致； 在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会

10、受到抑制。在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会受到抑制。2）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。3）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。大肠杆菌大肠杆菌提提 取取 液液上清上清50%饱和硫酸铵饱和硫酸铵33%饱和饱和硫酸铵硫酸铵悬于悬于42%饱和饱和硫酸铵中硫酸铵中沉淀沉淀上清上清上清上清弃去弃去沉淀沉淀弃去弃去沉淀沉淀酶酶大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶的制备聚合酶的制备3）盐析注意事项）盐析注意事项 沉淀反应在缓冲溶液中进行； 盐析完全需要一定时间； 能否多次盐析靠试验确定； 盐析后应及时脱盐（常

11、用透析）。v防止非均态出现；防止非均态出现；v防止低温增溶（少数在防止低温增溶（少数在0-10）；）；v注意分离方法与介质的密度和黏度的关系。注意分离方法与介质的密度和黏度的关系。脱盐的方法脱盐的方法四、盐析方法的应用 盐析法由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的初级分离。 胸腺提取液加热去杂蛋白上 清 液丙 酮 粉丙酮沉析(-10)上 清 液磷酸盐缓冲液中溶解、加硫酸铵饱和度为0.25盐 析 物加硫酸铵饱和度为0.50超 滤胸腺素硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程沉淀+PBS继续纯化上清液含

12、-球蛋白沉淀含-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达45%饱和度饱和度加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达20%饱和度饱和度血浆+PBS上清液含血清蛋白沉淀+PBS上清液沉淀含纤维蛋白上清液沉淀含-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度上清液为-球蛋白沉淀为-球蛋白加饱和硫酸铵达加饱和硫酸铵达30%饱和度饱和度硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程第二节第二节 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量向水溶液中加入一定量亲水性亲水性的有机溶剂，降的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。低溶质的

13、溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 优点：优点：产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。缺点：缺点：易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一定毒性。定毒性。 *A A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D D有机有机 D D水）水） ，减小溶减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的

14、作用力，因相互吸引而聚合沉淀。因相互吸引而聚合沉淀。*B B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。的水化层，使蛋白质沉淀。*C C 相反力：相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。疏水层。一、有机溶剂沉淀法基本原理有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介

15、电常数破坏水化膜二、影响沉淀效果的因素二、影响沉淀效果的因素有机溶剂种类及用量有机溶剂种类及用量pHpH值值温度温度无机盐含量无机盐含量金属离子金属离子样品浓度样品浓度1、有机溶剂种类及用量2100120SSSVV选择原则： 水溶性要好（与水无限混溶）水溶性要好（与水无限混溶） 介电常数要小介电常数要小 致变性作用要小致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中用量计算：2、溶液、溶液pH值：值： 目标蛋白与杂质带有相同的电荷，一般目标蛋白与杂质带有相同的电荷，一般pI附近附近3、温度：（预冷）温度：（预冷） 低温防止变性，有利于提高收率（溶解度下降）；低温防止变性，有利于提高收率

16、（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热）（有机溶剂溶于水放热）4、无机盐含量、无机盐含量: 离子强度低有利于沉淀，离子强度低有利于沉淀，0.010.05mol/L5、金属离子助沉淀作用：、金属离子助沉淀作用： CaCa2+2+、ZnZn2+2+等多价阳离子。等多价阳离子。6、样品浓度、样品浓度: 0.52% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水水 过滤过滤 水抽提上清液水抽提上清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀

17、粉酶淀粉酶 * pH影响影响 收率收率% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 适宜的适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响温度影响 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 适宜的温度适宜的温度10 20 结晶的概念：结晶的概念：第四节第四节 结结 晶晶 只有同类分子或离子才能排列成晶体，只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有因此结晶过程有良好的选择性良好的选择性。 通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高纯度较高的晶体。的晶体。 结晶过程具有结晶

18、过程具有成本低、设备简单、操作成本低、设备简单、操作方便方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的生素、维生素、核酸等产品的精制精制。结晶操作的特点结晶操作的特点结晶包括三个过程：结晶包括三个过程： 过饱和溶液的形成；过饱和溶液的形成； 晶核的形成；晶核的形成；晶体的生长。晶体的生长。溶液达到过饱和是结晶的前提，过溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。饱和度是结晶的推动力。一、结晶过程一、结晶过程饱和溶液过饱和溶液饱和曲线和过饱和曲线二、过饱和溶液的形成方法(1)(1)溶剂蒸发法溶剂蒸发法 (2)(2)温度诱导法温度诱导法(3)(3

19、)盐析结晶法盐析结晶法(4)(4)透析结晶法透析结晶法(5)(5)有机溶剂结晶法有机溶剂结晶法(6)等电点法(7)微量扩散法(8)化学反应结晶法(9)共沸蒸馏结晶三、三、 提高晶体质量的途径提高晶体质量的途径晶核的形成晶核的形成(1) (1) 初级成核初级成核: :过饱和溶液中的过饱和溶液中的自发成核自发成核现象（现象（不稳定区不稳定区）。）。(2) (2) 二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生会有新晶核产生机理机理: : 附着在晶体表面的微小晶体受到附着在晶体表面的微小晶体受到剪切剪切作作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。 在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为这种现象称为晶体生长晶体生长。晶体生长速度也是。晶体生长速度也是影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。如影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。如果果晶核形成速度大大超过晶体生长速度晶核形成速度大大超过晶体生长速度，则，则过饱和