高效液相色谱仪使用注意事项[1]

1、岛津液相色谱仪使用注意事项     1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。      2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。     3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。     4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆

2、外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。     5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。     6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。     7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。     8.堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器单向阀检查并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用1

3、0稀硝酸清洗。     9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。     10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。     11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。     12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进

4、行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。    1、样品的前处理：     a、最好使用流动相溶解样品。     b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。     c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒

5、杂质。 流动相的配制液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：     a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。     b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。     c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。    &

6、#160;d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。     e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。     f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。   3、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择

7、1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。 注意：     a由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。     b对于正相柱推荐使用沸程为30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。    &

8、#160;c含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。     d流动相要求使用0.45 µm滤膜过滤，除去微粒杂质。     e使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能常见故障的断定及解决方法诊状可能的原因及解决方法      (一)保留时间变化          1.柱温变化 柱恒温

9、，必要时需配置恒温箱         2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱         3.缓冲液容量不够用 25mmol/L的缓冲液         4.柱污染 每天冲洗柱         5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相 &#

10、160;       6.柱快达到寿命 采用保护柱     (二)保留时间缩短         1.流速增加 检查泵,重新设定流速        2.样品超载 降低样品量        3.键合相流失 流动相pH值保持在37.5，检查柱的方向 

11、60;      4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀        5.温度增加 柱恒温      (三)保留时间延长         1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡        2.硅胶柱上活性点变化 用流动相

12、改性剂,如加三乙胺,或采用碱质钝化柱        3.键合相流失 同前(二)3        4.流动相组成变化 同前(二)4       5.温度降低 同前(二)5     (四) 出现肩峰或分叉        1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积

13、小于第一峰的15%        2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂        3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件        4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品        5.进样器损坏 更换进样器转子 &

14、#160;   (五)鬼峰        1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗        2.样品中未知物 处理样品        3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)        4.三氟乙酸(TF

15、A)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂        5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水     (六) 基线噪声         1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压        2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂   

16、0;    3.检测器灯连续噪声 更换氘灯        4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)        5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压     (七)峰拖尾         1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

17、60;       2.峰干扰 清洁样品,调整流动相        3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱质钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相pH值，钝化样品        4.同前(四)4 同前(四)4        5.同前(四)3 5.同前(四)3   &

18、#160;    6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管        7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱      (八)峰展宽         1.进样体积过大 同(四)1        2

19、.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散        3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点        4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%        5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相        6.检

20、测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器        7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱        8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小        9.样品过载 进小浓度小体积样品液相色谱仪使用操作规程液相色谱仪使用操作规程总流程：    超纯水冲洗柱流动相分离样品超纯水冲洗柱

21、纯乙睛保存柱1 电源准备 打开稳压器电源开关，须待电压指示至 220V 后，才能开启其他有关设备。2 HP1100 高效液相色谱仪的准备          试剂：三氟乙酸      乙腈(Fisher 公司产品色谱纯)    超纯水(Millipore 超纯水)    冰乙酸    溶液配置：贮液瓶与流动相的准备

22、60;   A 液 0.1%三氟乙酸 （三氟乙酸 1ml，超纯水 999ml）室温保存    B 液 60%乙腈 （乙腈 600ml， 超纯水 400ml）室温保存    样品液 0.01%乙酸 （冰乙酸0.01ml，超纯水 100ml）室温保存     泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是 1%色谱纯甲醇 室温保存    注：贮液瓶应用超纯水清洗干净，备用。    流动相

23、溶剂用洁净硼砂漏斗精滤除去微小颗粒。      操作者必须清楚并注明 A、B 贮液瓶盛装为何种溶剂。    冲 洗 泵 头 ： 用 注 射 管 于 软 塑 料 管 末 端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 调 节 流 速 开 关 控 制 流 速 为20-30drop/min.。     流动相管道排气    如果管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动，用注射管于流动相出口的塑料管末端抽

24、吸至管道内气泡排除完全。操作时，我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。）     开机     进入 HP1100 操作系统     a.双击 WIN-95 操作界面中左下角 Instrument 1 online 图标，进入 HP1100 工作站软件操作界面。单击工作站操作界面上方 Run control 菜单，在下拉菜单中找到 Sample Info 子菜单，单击。在 Sample Info 信息框内定义操作者、样品前缀及编

25、号、保存路径等参数。在保存路径项下，将可定义子目录分别输入操作者拼音缩写，以方便检索时互不干扰。    b.等待工作站操作界面中泵、柱温箱、检测器各指示图标由灰色转变为绿色后，单击泵、检测器各图标可从其各自弹出的菜单中设定流动相各溶剂比例、流速等。     （1） 流速通常为 1ml/min。检测波长通常为 280，或者 254nm。     （2） A 液设置为 100%，运行 15-30 分钟（目的是色谱柱的预平衡），观察基线走势，基线应为直线，通过单击“Balance”

26、键可将基线调至零点。待基线平稳后可进样。       （3） 调整 A 液为 0，B 液为 100%再运行 60 分钟（此时乙腈实际浓度为 60%）     （4） 在 A 液冲洗同时进行进样环的冲洗：用 500l 的针样注射器，在 load 状态，注入超纯水 500l。（反复三次，若是 20l 进样环，则加入 20l 以上，多余的水可废液管流出。通常同一样品上样 30 次后应冲洗进样环，如果不同样品，最好，每次上样前均进行冲洗。）      （5） 吸取

27、一定量可直接进样的样品溶液（上样液最好用滤器滤过），将进样阀逆时针旋至Load 档，将进样针从进样孔处水平推入，按进样器活塞将样品溶液注射入进样环后，立即将进样阀顺时针方向旋至 Inject 档，与此同时，数据开始自动收集。     （6） 此时样品分析已经完成。在 HP1100 主操作界面的检测器图标，关闭检测器，然后关闭色谱仪主机检测器开关（目的是延长检测器寿命）。将 B 通道调为 0，A 通道调为 100%，即 A 液冲洗色谱柱约 10-30min。用 A 液续冲洗色谱柱约 10-30m（目的是冲出柱内残留的杂质）   

28、;  （7） A 通道换为 C 通道（100%乙腈）续冲洗色柱约 10-30min。（目的主要为保护柱）     数据记录的终止与保存    电脑将自动收集并保存数据，终止运行后，将自动弹出数据框，或者可通过 DATA ANALYSIS菜单，调出资料。  3 图谱处理4 关机    1） HP1100 的关闭     在 HP1100 的主操作界面上分别单击关闭泵、检测器图标，或通过菜单关闭 。然后，单击H

29、P1100 的主操作界面右上方“X”，退出 Instrument 1 online 程序，返回至 WIN-95 操作界面。单击左下角“Start”菜单，单击“Shut down”,等待关机，待出现“Restart”提示后，按电脑主机电源键，关闭电脑主机及显示器。将所有使用仪器用布盖好。关闭排气扇、空调与稳压器开关。    2） 清洁卫生     实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。    3） 仪器使用记录     记录

30、当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字.液相色谱仪使用及维护方法     液相色谱仪使用时要非常注意。     使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。      液相色谱柱使用注意：     卡套柱的安装（加预柱）        

31、  1将卡套架套入柱芯     2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图）     3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片     4将"子弹头"预柱放入卡套片内     5将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧     6然后依同样的顺序连接好柱子的另一端        

32、60; 平衡色谱柱           反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。      硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡  

33、        如何平衡色谱柱？     平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）          色谱柱的再生      进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。         &#

34、160; 注意：          在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。          色谱柱的维护      1使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） &

35、#160;   2大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围      3避免流动相组成及极性的剧烈变化     4流动相使用前必须经脱气和过滤处理     5如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇/乙腈中      6压力升高是需要更换预柱的信号液相色谱的常用术语1、色谱曲线chromatogram）：在色谱法中，当样品加入后，样品中各组分随着流动

36、相的不断向前移动而在两相间反复进行溶解、挥发，或 吸附、解吸的过程。如果各组分在固定相中的分配系数（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能达到分离。分配系数小的组分滞留在固定相中的时间短，在柱内移动的速度快，先流出柱子；分配系数大的组分滞留在固定相中的时间长，在柱内移动的速度慢，后流出柱子；分离后的各组分经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线或 “色谱峰”，理想的色谱流出曲线应该是正态分布曲线。2、（色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。3、峰底（peak base）：峰的起点与终点

37、之间的连接的直线。4、峰高（h ，peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离。5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点的距离。6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（gho

38、st peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。 12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。柱的使用和维护注意事项(推荐)色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱

39、从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在

40、进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃

41、与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢勺将柱头填料取出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。 通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在p