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文档简介

1、CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质1. 固定化处理对酶性质的影响固定化处理对酶性质的影响 从溶液酶的游离状态,到固定化酶的从溶液酶的游离状态,到固定化酶的“局限局限”状态,是一个很大的转变。不仅酶分子本身,状态,是一个很大的转变。不仅酶分子本身,而且酶反应的环境也有所不同。因而,固定化而且酶反应的环境也有所不同。因而,固定化酶的性质与溶液酶大相径庭酶的性质与溶液酶大相径庭固定化酶的制备方法很多,酶在固定化过程中,固定化酶的制备方法很多,酶在固定化过程中,对酶反应系统产生的影响各不相同。对酶反应系统产生的影响各不相同。我们我们假定假定酶固定化之后,在载体表面或多孔介质内的分酶固定化之后,在

2、载体表面或多孔介质内的分布完全均匀布完全均匀,我们不考虑固定化处理过程中,我们不考虑固定化处理过程中,技术操作的问题,我们技术操作的问题,我们可以将固定化带来影响可以将固定化带来影响概括为如下三个方面:概括为如下三个方面: 构象改变、立体屏蔽构象改变、立体屏蔽酶在固定化过程中,由于酶和载体之间相互作用,引起酶分子构象发酶在固定化过程中,由于酶和载体之间相互作用,引起酶分子构象发生某种扭曲,从而导致酶与底物的结合能力或催化底物转化能力发生生某种扭曲,从而导致酶与底物的结合能力或催化底物转化能力发生改变,在大多数情况下,固定化致使酶活性不同程度下降。而立体屏改变,在大多数情况下,固定化致使酶活性不

3、同程度下降。而立体屏蔽是指固定化后,由于载体孔隙太小,或固定化的结合方式不对蔽是指固定化后,由于载体孔隙太小,或固定化的结合方式不对( (如图如图所示所示) )使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍,使效应物或底物与使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍,使效应物或底物与酶的邻近或接触受到限制。酶的邻近或接触受到限制。图 固定化酶的立体屏障效应活性中心向里活性中心向里活 性 中 心 向活 性 中 心 向外外 分配效应和扩散限制分配效应和扩散限制这两种效应都和微环境密切相关。所谓微环境是指紧邻固这两种效应都和微环境密切相关。所谓微环境是指紧邻固定化酶的环境区域,主要是载体的疏水亲水及电荷性质带定

4、化酶的环境区域,主要是载体的疏水亲水及电荷性质带来的影响。来的影响。 分配效应分配效应 是由于载体性质造成的酶的底物或其他效是由于载体性质造成的酶的底物或其他效应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配,从而影响应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配,从而影响酶促反应速度的一种效应。酶促反应速度的一种效应。 扩散限制效应扩散限制效应 是指底物、产物和其它效应物在环境是指底物、产物和其它效应物在环境中的迁移运转速度受到的限制作用。有外扩散限制和内扩中的迁移运转速度受到的限制作用。有外扩散限制和内扩散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固

5、定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层( (又称又称NernslNernsl层层) )达到颗达到颗粒表面时所受到的限制。内扩散限制是指上述物质进一步粒表面时所受到的限制。内扩散限制是指上述物质进一步向颗粒内部酶所在点扩散所受到的限制。向颗粒内部酶所在点扩散所受到的限制。 微扰微扰由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质,直由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力,这种接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力,这种效应称为微扰。目前还不能作定量描述。实际上构象改变,效应称为微扰。目前还不能作定量描述。实际上构象

6、改变,立体屏蔽效应,也还不能作定量描述。近年来,关于蛋白立体屏蔽效应,也还不能作定量描述。近年来,关于蛋白质质“可及表面可及表面”计算方法的进展,似为这几种效应的定量计算方法的进展,似为这几种效应的定量讨论,展示了一种前景。以上效应将具体表现在酶的动力讨论,展示了一种前景。以上效应将具体表现在酶的动力学性质、酶的稳定性、酶促反应影响因素、乃至酶的底物学性质、酶的稳定性、酶促反应影响因素、乃至酶的底物专一性等方面。专一性等方面。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质2. 固定化的酶性质固定化的酶性质 分配效应对分配效应对KmKm的影响的影响 这种影响通常用分配系数这种影响通常用分配系数()()

7、来描述:来描述:SiSi S (1)S (1)式中式中 SiSi 和和SS分别表示底物或其它效应分别表示底物或其它效应物在微环境中的局部浓度和宏观体系中物在微环境中的局部浓度和宏观体系中的总体的总体( (或平均或平均) )浓度。浓度。对最简单的固定化酶系统而言,其动力学性态,一般仍对最简单的固定化酶系统而言,其动力学性态,一般仍服从米氏方程。当反应系统进行充分搅拌,消除外扩散服从米氏方程。当反应系统进行充分搅拌,消除外扩散限制影响时,只考虑分配效应的影响,则反应速度可表限制影响时,只考虑分配效应的影响,则反应速度可表示如下:示如下: VmaxSiVmaxSi v= (2) v= (2) Km+

8、Si Km+Si Vmax VmaxS S = (3) = (3) Km+S Km+S VmaxS Vmax VmaxS VmaxSS = = (4) = = (4) Km/+S K Km/+S Km+Sm+S K Km= Km/ (5)m= Km/ (5)这表明分配系数的影响,是改变了这表明分配系数的影响,是改变了KmKm。K Km m是分配效应是分配效应影响下的表观米氏常数。由式影响下的表观米氏常数。由式(1)(1)和和(5)(5),可以看出,可以看出 SiSi SS,则,则1 1, K Km mKmKm,表明固定化作用降低酶,表明固定化作用降低酶对底物的亲和力。对底物的亲和力。 通过载体

9、和底物电荷性质、离子强度和通过载体和底物电荷性质、离子强度和pHpH值对分配值对分配效应的影响讨论,可以得出一般性规律如下:效应的影响讨论,可以得出一般性规律如下: 载体与底物带相同电荷时,相斥,载体与底物带相同电荷时,相斥, SiSi SS,K Km mKmKm。 当载体带正电荷时,局部当载体带正电荷时,局部H H+ + 浓度低于总体浓度,浓度低于总体浓度, SiSi 变大,变大,K K变小,即酶活力一变小,即酶活力一pHpH曲线向酸性方向偏移,曲线向酸性方向偏移,亦即最适亦即最适pHpH向酸性方向偏移;反之,离子载体将向碱性向酸性方向偏移;反之,离子载体将向碱性方向偏移,如图所示。方向偏移

10、,如图所示。1. 载体带正电荷,载体带正电荷, 最适最适pH向偏酸性偏移;向偏酸性偏移;2. 游离酶的最适游离酶的最适pH3.3.载体带负电荷,载体带负电荷, 最适最适pH向偏碱方向偏移;向偏碱方向偏移; V 上述效应,通过提高反应系统的离子强度,上述效应,通过提高反应系统的离子强度,可以减弱或消除。当离子强度等于载体电荷基团可以减弱或消除。当离子强度等于载体电荷基团浓度一半时,浓度一半时,K Km mKmKm2 2,当离子强度远大于,当离子强度远大于载体电荷基团浓度时,载体电荷基团浓度时,K Km mKmKm。 采用疏水性载体时,如底物为极性物质或电采用疏水性载体时,如底物为极性物质或电荷性

11、物质,则荷性物质,则Si小,小,KmKm;如底物为疏水;如底物为疏水性物性物 CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质2. 固定化的酶性质固定化的酶性质 扩散限制效应扩散限制效应 酶固定化之后,由于扩散限制,使得酶往往不能酶固定化之后,由于扩散限制,使得酶往往不能得到宏观体系相同水平的底物,因而观测到的实效反得到宏观体系相同水平的底物,因而观测到的实效反应速度,常低于理论预测的水平。对于这种影响,通应速度,常低于理论预测的水平。对于这种影响,通常引用实效系数常引用实效系数O O进行定量讨论。进行定量讨论。 v=v=O Ov vp p O O = v /v = v /vp p (1 1)式中式中

12、v v为实效反应速度,为实效反应速度,v vp p为理论预期反应速度,即由溶液酶的为理论预期反应速度,即由溶液酶的米米孟氏方程确定的速度。孟氏方程确定的速度。 VmaxVmaxSS VmaxS 由由 v= v= O (2 2) Km+S Km+S Km+S 如前所述,扩散包括外扩散和内扩散两方面。如前所述,扩散包括外扩散和内扩散两方面。 外扩散实际上包括分子扩散和对流扩散两部外扩散实际上包括分子扩散和对流扩散两部分。在固定化酶反应操作中,可以通过搅拌混和分。在固定化酶反应操作中,可以通过搅拌混和而消除或削弱其限制作用。动力学分析指出,外而消除或削弱其限制作用。动力学分析指出,外扩散限制效应影响

13、下,酶反应实效速度一般低于扩散限制效应影响下,酶反应实效速度一般低于酶促转化动力学规定的速度。因此,这种扩散限酶促转化动力学规定的速度。因此,这种扩散限制可以看作是一种抑制效应,可称为扩散抑制。制可以看作是一种抑制效应,可称为扩散抑制。 内扩散限制对酶反应动力学的影响,在某种程度上比外扩散限制更内扩散限制对酶反应动力学的影响,在某种程度上比外扩散限制更突出,更重要。动力学理论分析所得出的一些主要结论有以下三点,突出,更重要。动力学理论分析所得出的一些主要结论有以下三点,可以用定性的语言来描述。可以用定性的语言来描述。 底物和其它效应物分子量对扩散速率的影响分析表明,一般情底物和其它效应物分子量

14、对扩散速率的影响分析表明,一般情况下,固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的实效反应速度况下,固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的实效反应速度下降程度比溶液酶更大。许多实验结果与此理论分析是一致的。下降程度比溶液酶更大。许多实验结果与此理论分析是一致的。 载体结构的影响分析表明,内扩散限制取决于载体的孔隙率、孔载体结构的影响分析表明,内扩散限制取决于载体的孔隙率、孔隙半径、孔隙曲折程度。即:底物的内扩散系数与载体孔隙率成正比,隙半径、孔隙曲折程度。即:底物的内扩散系数与载体孔隙率成正比,与底物在宏观体系中固有的扩散系数成正比,与载体孔隙的曲折系数与底物在宏观体系中固有的扩散系数成正比

15、,与载体孔隙的曲折系数成反比,与载体膜厚度或载体颗粒半径的平方成反比。实验支持了这成反比,与载体膜厚度或载体颗粒半径的平方成反比。实验支持了这一理论分析。一理论分析。 内扩散限制与酶反应固有速度有关。即是说固有反应速度内扩散限制与酶反应固有速度有关。即是说固有反应速度v vp p 大,大,酶反应的底物转移系数也大,当酶反应的底物转移系数也大,当SS小于小于0.1 Km0.1 Km时,时,O O大,则固定化大,则固定化酶反应速度也相对大。酶反应速度也相对大。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 酶活力回收率酶活力回收率 游离酶经过固定化以后,酶活力往

16、往下降。游离酶经过固定化以后,酶活力往往下降。固定化酶所保固定化酶所保留下来的酶活力与游离酶在固定化之前的酶活力之比,称为该酶留下来的酶活力与游离酶在固定化之前的酶活力之比,称为该酶活力回收率,也叫固定化效率、残存活力等。活力回收率,也叫固定化效率、残存活力等。在不考虑扩散限制在不考虑扩散限制影响的情况下,固定化酶的酶活力回收率可以通过实验测得影响的情况下,固定化酶的酶活力回收率可以通过实验测得由下式求得:由下式求得: V Vm m .B .Bimim F Fimim 100% 100% V Vm m .B .B式中式中F Fimim为活力回收率为活力回收率( () ),B B为固定化前所用的

17、游离酶溶液体积;为固定化前所用的游离酶溶液体积;B Bimim为制得的固定化酶湿体积;为制得的固定化酶湿体积;V Vm m 为固定化前的酶的最大反应速为固定化前的酶的最大反应速度;度;V Vm m 固定化酶测得的表观最大反应速度。固定化酶测得的表观最大反应速度。关于固定化酶收率问题,有不同得报道,上述方法考虑了在固定化处关于固定化酶收率问题,有不同得报道,上述方法考虑了在固定化处理过程中,有未被固定化的酶蛋白、在固定化过程中失活的酶蛋白以理过程中,有未被固定化的酶蛋白、在固定化过程中失活的酶蛋白以及在固定化后及在固定化后KcatKcat的变化(降低或升高);的变化(降低或升高);而另一种方法是

18、:而另一种方法是: V Vm m .B.Bimim F Fimim 100% 100% V Vm m . .(B BB B)式中符号与上式相同,式中符号与上式相同,B B为固定化处理后,回收的未固定的酶蛋白为固定化处理后,回收的未固定的酶蛋白的量。实际上这种方法,只考虑了在固定化处理过程中,固定化方法的量。实际上这种方法,只考虑了在固定化处理过程中,固定化方法对酶蛋白构型、活性中心等的影响,把未被固定化的酶蛋白作为回收对酶蛋白构型、活性中心等的影响,把未被固定化的酶蛋白作为回收考虑。考虑。 固定化酶的话力回收率因所采用的固定化方法而异。一般固定化酶的话力回收率因所采用的固定化方法而异。一般来说

19、,来说,F Fimim 值按下列固定化方法顺序递减:值按下列固定化方法顺序递减: 吸附法凝胶包埋法微型胶囊包埋法交联法吸附法凝胶包埋法微型胶囊包埋法交联法 例如,李增吉等例如,李增吉等(1993(1993年年) )报道,用报道,用DEAEDEAE纤维素直接纤维素直接吸附天冬氨酸酶,酶活力回收达吸附天冬氨酸酶,酶活力回收达9090;以聚乙烯基吡啶与;以聚乙烯基吡啶与聚甲基丙烯酸复合物包埋同一酶,当加酶量为每聚甲基丙烯酸复合物包埋同一酶,当加酶量为每1 1克复合物克复合物8.40mg8.40mg和和16.8mg16.8mg时,酶活力回收分别可达时,酶活力回收分别可达8787和和9494。姜。姜涌明

20、等涌明等(1993(1993年年) )用壳聚糖作载体,戊二醛作交联剂,分别用壳聚糖作载体,戊二醛作交联剂,分别对木瓜蛋白酶、对木瓜蛋白酶、AS1.398AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶进行固定化,在最佳条件下,固定化酶的活力回收率分别进行固定化,在最佳条件下,固定化酶的活力回收率分别为为4747、7474、5050和和5555。 底物专一性变化底物专一性变化 对于作用于大分子底物的酶,当其固定于水不溶性载体之对于作用于大分子底物的酶,当其固定于水不溶性载体之后,往往由于空间障碍,而使酶对分子量大的底物的催化后,往往由于空间障碍,而使酶对分子量大的底物的

21、催化活性大大下降。例如,糖化酶用活性大大下降。例如,糖化酶用CM一纤维素经化学法共一纤维素经化学法共价固定化后,对分子量为价固定化后,对分子量为8000的直链淀粉的催化活性下降的直链淀粉的催化活性下降23,而对分子量为,而对分子量为500000的直链淀粉的催化活性下降的直链淀粉的催化活性下降85一一87。 反应的最适反应的最适pH值变化值变化许多实验证明,酶固定化后的反应最适许多实验证明,酶固定化后的反应最适pH值会发生不同程值会发生不同程度的变化。例如,天冬氨酸酶固定于疏水载体度的变化。例如,天冬氨酸酶固定于疏水载体N烷基琼脂烷基琼脂糖珠之后,酶的最适反应糖珠之后,酶的最适反应pH与液酶相比

22、,向碱性区移动了与液酶相比,向碱性区移动了04个个pH单位,(为单位,(为pH89马林等,马林等,1991)。 胰蛋白酶用胰蛋白酶用戊二醛固定于脱乙酰壳聚糖载体后,最适戊二醛固定于脱乙酰壳聚糖载体后,最适pH范围加宽,由范围加宽,由液相酶的液相酶的pH8.0变为变为pH7.09.0(隋德新等,隋德新等,1991)。另外也。另外也有实验证明固定化酶最适有实验证明固定化酶最适pH移向酸侧的。移向酸侧的。 反应最适温度的变化反应最适温度的变化固定化酶的最适反应温度,在很多情况下是高于游离酶的。固定化酶的最适反应温度,在很多情况下是高于游离酶的。同上实验的固定化天冬氨酸酶最适反应温度提高了同上实验的固

23、定化天冬氨酸酶最适反应温度提高了5,为为50;胰蛋白酶也提高了;胰蛋白酶也提高了5,为,为60,而且即使在,而且即使在70仍有较高的活性。用仍有较高的活性。用CM纤维素叠氮衍生物固定化的纤维素叠氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度则比游离酶高胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度则比游离酶高515。也有固定化酶的最适温度不变的,例如壳聚糖固定化胃蛋也有固定化酶的最适温度不变的,例如壳聚糖固定化胃蛋白酶。白酶。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 米氏常数变化米氏常数变化 酶被固定化后,米氏常数的变化前已推导,下表所列固酶被固定化后,米氏常数的变化前已

24、推导,下表所列固定化酶的定化酶的Km值与游离酶的值与游离酶的Km值之比值:值之比值:酶载 体固定化方法底 物Km/ Km无花果酶肌酸激酶天冬酰胺酶木瓜蛋白酶 CM-纤维素CM-纤维素尼龙火棉胶 肽键结合法 肽键结合法微囊吸附 苯甲酰精氨酸乙酯ATP、肌酸Asn苯甲酰精氨 0.9 101021.8 一般来说,酶在固定化以后,一般都表现为一般来说,酶在固定化以后,一般都表现为Km值增值增大,即大,即Km/Km大于大于l。 CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 最大反应速度的变化最大反应速度的变化固定化酶的最大反应速度固定化酶的最大反应速度( (V Vm

25、)m)与游离酶的与游离酶的VmVm值大值大多基本相同,多基本相同,事实上,对于最大反应速度的比较是很难进行的,事实上,对于最大反应速度的比较是很难进行的,因为因为VmVm与反应体系中的加酶量有关,单纯与反应体系中的加酶量有关,单纯VmVm的比较,的比较,也难以说明什么问题,最客观的比较参数应该是也难以说明什么问题,最客观的比较参数应该是KcatKcat但到目前笔者尚未收到有关研究资料报道。但到目前笔者尚未收到有关研究资料报道。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质4. 固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性 固定化酶的热稳定性固定化酶的热稳定性大多数酶经固定化以后,热稳定性提高。大多数酶经固定化以

26、后,热稳定性提高。例如,乳酸脱氢酶、脲酶、氨基酰化酶、胰蛋白酶等,例如,乳酸脱氢酶、脲酶、氨基酰化酶、胰蛋白酶等,固定化后,热稳定性都比游离酶高;固定化后,热稳定性都比游离酶高;也有固定化之后耐热性反而下降的例子。也有固定化之后耐热性反而下降的例子。DEAEDEAE纤维素离子交换吸附的转化酶,纤维素离子交换吸附的转化酶,4040加热加热3030分钟,分钟,其剩余活力为其剩余活力为4 4,而游离酶,在相同条件下其活力为,而游离酶,在相同条件下其活力为100100。 固定化酶对化学试剂的稳定性固定化酶对化学试剂的稳定性大多数情况下,酶固定化之后,增强了对化学试剂的耐受大多数情况下,酶固定化之后,增

27、强了对化学试剂的耐受力。例如氨基酰化酶,用力。例如氨基酰化酶,用DEAEDEAE葡聚糖交换吸附法制成固葡聚糖交换吸附法制成固定化酶后,在定化酶后,在6 6molmolL Ll l尿素、尿素、2 2molmolL Ll l中,保存活力分中,保存活力分别为别为146146和和117117;而游离酶在相应条件下,保存活力仅;而游离酶在相应条件下,保存活力仅9 9和和4949。CMCCMC偶联的胰蛋白酶,在偶联的胰蛋白酶,在3 3molmolL Ll l 脲中的保脲中的保存活力为存活力为120120,游离酶只,游离酶只6060。尿素、盐酸脲这样的蛋。尿素、盐酸脲这样的蛋白质变性剂,不仅没有损失固定化酶

28、的活性,反而提高酶白质变性剂,不仅没有损失固定化酶的活性,反而提高酶活性的现象,据认为可能与酶的柔顺性增加有关。个别酶活性的现象,据认为可能与酶的柔顺性增加有关。个别酶如葡萄糖淀粉酶,固定化以后,对某些抑制剂更为敏感。如葡萄糖淀粉酶,固定化以后,对某些抑制剂更为敏感。 固定化酶对蛋白酶的稳定性固定化酶对蛋白酶的稳定性一般来说,酶固定化以后,增强了对蛋白一般来说,酶固定化以后,增强了对蛋白酶的抵抗力。例如用尼龙或聚服膜包埋,酶的抵抗力。例如用尼龙或聚服膜包埋,或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶,对蛋或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶,对蛋白酶极为稳定,而游离酶在同样条件下,白酶极为稳定,而游离酶在同样条

29、件下,几乎全部失活。据认为,这可能与固定化几乎全部失活。据认为,这可能与固定化酶的载体不允许大分子酶蛋白透过有关。酶的载体不允许大分子酶蛋白透过有关。 固定化酶的操作稳定性和贮藏稳定性固定化酶的操作稳定性和贮藏稳定性大多数酶固定化以后,操作稳定性和贮藏稳定性都明显提大多数酶固定化以后,操作稳定性和贮藏稳定性都明显提高。这对工业生产是很重要的有利性质。例如三酯酸纤维高。这对工业生产是很重要的有利性质。例如三酯酸纤维素包埋的转化酶,在素包埋的转化酶,在2525操作操作530530日,活力仅丧失一半。日,活力仅丧失一半。重氮化结合于多孔玻璃的葡萄糖异构酶,重氮化结合于多孔玻璃的葡萄糖异构酶,6060

30、下的半寿期下的半寿期为为1414天。一般说来,操作稳定性要有一个月以上的半寿期,天。一般说来,操作稳定性要有一个月以上的半寿期,才有工业应用价值。才有工业应用价值。 贮藏稳定性下降的例子也存在。游离核酸酶贮藏稳定性下降的例子也存在。游离核酸酶44下保下保存一周,活力不减;而共价固定化酶存一周,活力不减;而共价固定化酶( (载体苯乙烯马来酐载体苯乙烯马来酐) )则丧失则丧失5050的活力。的活力。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质5. 固定化酶稳定性的途径固定化酶稳定性的途径探讨固定化过程增强酶稳定性的机制,从中寻求提高探讨固定化过程增强酶稳定性的机制,从中寻求提高固定化酶稳定性途径,是值

31、得重视的课题,不少研究固定化酶稳定性途径,是值得重视的课题,不少研究者已在这方面作了有益探索。初步归纳有以下几点者已在这方面作了有益探索。初步归纳有以下几点。 用化学修饰增加与载体相反的电荷用化学修饰增加与载体相反的电荷 例如用乙酰酐例如用乙酰酐和琥珀酰酐作为酶的酰化剂,酶经酰化后与阴离子交和琥珀酰酐作为酶的酰化剂,酶经酰化后与阴离子交换剂换剂DEAE纤维素结合。如此制备的固定化葡萄糖纤维素结合。如此制备的固定化葡萄糖淀粉酶,淀粉酶,55糖化可溶性淀粉,经糖化可溶性淀粉,经7.5小时,酶活力保小时,酶活力保留留71,而未经酰化的固定化酶,只保留,而未经酰化的固定化酶,只保留17的活力。的活力。

32、 固定化酶与底物形成复合物固定化酶与底物形成复合物 研究固定化多核苷酸研究固定化多核苷酸磷酸化酶微环境对酶稳定性的作用时,证明固定化酶磷酸化酶微环境对酶稳定性的作用时,证明固定化酶与其反应产物大分子核酸形成的复合物,对酶的稳定与其反应产物大分子核酸形成的复合物,对酶的稳定性起很大的作用。性起很大的作用。 在实际工作中,经常在固定化处理时,先将酶和在实际工作中,经常在固定化处理时,先将酶和底物结合,以酶底物复合物的形式进行,获得的固底物结合,以酶底物复合物的形式进行,获得的固定化酶的收率和稳定性都有明显改善。定化酶的收率和稳定性都有明显改善。 添加隋性蛋白质添加隋性蛋白质 研究固定化葡萄糖氧化酶

33、的稳定研究固定化葡萄糖氧化酶的稳定性指出,在固定化过程中,以性指出,在固定化过程中,以1 1:10(10(酶:酶:HbHb) )的比例添的比例添加血红蛋白,提高酶活性效果最为明显,这可能是惰加血红蛋白,提高酶活性效果最为明显,这可能是惰性蛋白质提供了对酶更为有利的微环境之故。性蛋白质提供了对酶更为有利的微环境之故。 增强载体凝胶多孔性和结构有序性增强载体凝胶多孔性和结构有序性 研究卡拉胶的研究卡拉胶的结构与其包埋的异构酶热稳定性的关系时,发现含硫结构与其包埋的异构酶热稳定性的关系时,发现含硫酸根多的卡拉胶,具有较好的孔隙性和结构上的有序酸根多的卡拉胶,具有较好的孔隙性和结构上的有序性。而这种有

34、序性与酶对底物的亲和力呈正相关。在性。而这种有序性与酶对底物的亲和力呈正相关。在制备固定化酶时,添加氨基葡萄糖,可提高胶的结构制备固定化酶时,添加氨基葡萄糖,可提高胶的结构有序性,同时得到了理想的酶稳定性。有序性,同时得到了理想的酶稳定性。 同时固定化能消除产物抑制的酶同时固定化能消除产物抑制的酶 葡萄糖氧化酶氧葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的产物之一为化葡萄糖的产物之一为H202,易使该酶钝化,若同时,易使该酶钝化,若同时固定化葡萄糖氧化酶固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化氢酶和过氧化氢酶(Cat),当,当CatGOD为为27时,固定化双酶,使葡萄糖氧化酶半寿期时,固定化双酶,使葡萄糖氧化酶半寿期

35、延长了延长了12倍。倍。25连续使用连续使用36小时活力不变,半寿期小时活力不变,半寿期达达1155小时小时(约:,约:,48天天)。 CH5-3固定化酶反应器固定化酶反应器1 1. .固定化酶反应器类型固定化酶反应器类型 酶反应器是以酶作为催化剂进行反应所需的设备。性酶反应器是以酶作为催化剂进行反应所需的设备。性能优良的反应器,可大大提高生产效率。能优良的反应器,可大大提高生产效率。酶反应器的形式很多,根据进料和出料方式,可概括酶反应器的形式很多,根据进料和出料方式,可概括为两种类型:为两种类型:分批搅拌式反应器分批搅拌式反应器(BR)(BR)与连续流式反应器与连续流式反应器( (CFR)C

36、FR)。后者又有两种基本形式:连续流搅拌桶后者又有两种基本形式:连续流搅拌桶( (罐罐) )反应器反应器(CST)(CST)、复合搅拌反应器(、复合搅拌反应器(CSRCSR)、填充床反应器)、填充床反应器(PR) (PR) 和流化床反应器(和流化床反应器(FBRFBR)。)。CH5-3固定化酶反应器固定化酶反应器 1 1. .固定化酶反应器类型固定化酶反应器类型 CH5-3固定化酶反应器固定化酶反应器 1 1. .固定化酶反应器类型固定化酶反应器类型 分批搅拌反应器分批搅拌反应器 这类反应器结构简单,不需特殊装置,适于小规这类反应器结构简单,不需特殊装置,适于小规模试验。目前我国酶反应器主要用

37、这种形式的反应器。模试验。目前我国酶反应器主要用这种形式的反应器。用溶液酶或粗酶制剂催化时,酶一般不回收,待反应用溶液酶或粗酶制剂催化时,酶一般不回收,待反应转化为一定程度后,直接加热或用其它方法使酶失效转化为一定程度后,直接加热或用其它方法使酶失效除去。这种反应器在工业生产中,很少采用固定化酶,除去。这种反应器在工业生产中,很少采用固定化酶,因为在反复过滤或离心回收过程中,容易造成酶失效因为在反复过滤或离心回收过程中,容易造成酶失效损失。损失。 填充床反应器填充床反应器 这是当前采用最多的一种反应器形式。这是当前采用最多的一种反应器形式。床内通常用颗粒状或片状固定化酶填充,也可平行地填充床内通常用颗粒状或片状固定化酶填充,也可平行地填充各向异性的半透性中空纤维;或者作成管状,内部填充酶各向异性的半透性中空纤维;或者作成管状,内部填充酶膜、酶片等。运转时,底物按照一定方向以恒定流速通过膜、酶片等。运转时,底物按照一定方

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