猪血液中超氧化物歧化酶SOD的提取及活力测定

1、猪血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力测定学校 青岛农业大学 学院 生命科学学院年级专业 生物技术1001姓名 毛嘉宁王颖摘 要哺乳类动物血液中存在着大量的生物活性物质 ,如超氧化歧化酶 (,简称)、凝血酶等。是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂，能催化生物体内超氧自由基（O2-）歧化反应，对机体细胞起保护作用，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。在临床上有广泛用途 (延缓人体衰老、防止色素沉着、消除局部炎症等 ) ,特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症。在实验中利用血块采用机械破碎法破膜，采用热变性和

2、乙醇氯仿沉淀去除杂蛋白，然后用丙酮沉淀得到粗SOD溶液。关键词：超氧化物歧化酶 分离提取 猪血1前言体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内。现已证实，在生物体内，SOD具有抗氧化、解毒等重要作用；在体外，具有抗辐射、抗肿瘤及抗衰老、增强人体免疫等功能，广泛用于医药、食品、化妆品等行业，市场广阔。猪血是SOD的重要来源，我国猪血资源十分丰富，具有独特的加工优势。本实验在加热法的基础上用有机溶剂丙酮沉淀超氧化物歧化酶SOD，将SOD从血液中提取出来。2实验目的：2.1了解SOD的生理功能2.2了解SOD的制备方法3实验原理： 超氧化物歧化酶(SOD)是一种金属酶，也是一种蛋白质，可在一定浓度的

3、酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀，可以利用这一特点，将SOD从血液中提取出来。3.1 加入柠檬酸三钠作为抗凝血剂使用，通过离心机离心，从猪血中分离出红细胞。3.2 利用95%乙醇洗掉DNA，利用氯仿抽提血红蛋白等杂蛋白，再通过离心作用进行离心分离。3.3 利用热变性原理，在随温度的升高和实验操作时间的延长，酶的活性和杂蛋白的含量均呈下降趋势，从比活性上讲猪血中的SOD在55-65变性。变性时间为1526min最适宜，酶纯度最高。3.4 利丙酮作为有机溶剂除杂，离心去沉淀。3.5 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出

4、02-，生成带色的中间产物，反应开始后先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30-45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。4 实验设备4.1恒温水浴 冰浴器 4.2离心机 4.3布氏漏斗、

5、抽滤瓶 、滤纸 4.4烧杯、量筒、玻璃棒5实验材料及试剂5.1猪血5.2 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠 5.3 0.9%（质量分数）氯化钠 5.4 95%（体积分数）乙醇 5.5 氯仿 5.6 丙酮 5.7 pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液5.8 去离子水 、蒸馏水5.9 pH8.2、50mmol/L Tris-HCla.称取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g,用双蒸馏水溶解至80ml左右，用HCl调节pH=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。5.10 10mmol/L HCl5.11 50mmol/L 邻苯三酚 a称取邻苯三酚0.0

6、63g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。6 实验操作步骤6.1分离血球 取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。 6.2除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入11.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤

7、液。 6.3热变性 上清液加热到65，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液。 6.4 沉淀清液在盐冰浴中冷却，然后在-5以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，快搅慢加，即有白色沉淀产生， 用4 000r/min离心20min，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液。6.5 邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl 代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定

8、光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。表1试剂空白管（ml）自氧化管（ml）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl3310mmol/L HCl0.10.0550mmol/L 邻苯三酚-0.056.6 SOD样液的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。表2试剂空白管（ml）自氧化管（ml）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl3310mmol/L HCl0.1-SOD样液-0.0550mmol/L 邻苯三酚-0.057 结果及计算酶活性（U/mL）=(0.070-样液速率)/0.070*100%/50%*反应液总体积*（液稀释倍数/样液体积）8 注意事项8.1 分离血球和血浆宜在15以下。8.2 SOD凝血酶和提取过程中应避免高温影响酶失活。9 费用预算参 考 文 献1 金国华.猪血提取超氧化歧化酶J用科技，1999（9）：3.2 李敬玺、刘继兰等.超氧化物歧化酶研究和应用进展J.动物医学进展，2007