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1、猪血液中超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活力测定学校 青岛农业大学 学院 生命科学学院年级专业 生物技术1001姓名 毛嘉宁王颖摘 要哺乳类动物血液中存在着大量的生物活性物质 ,如超氧化歧化酶 (,简称)、凝血酶等。是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂,能催化生物体内超氧自由基(O2-)歧化反应,对机体细胞起保护作用,己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。在临床上有广泛用途 (延缓人体衰老、防止色素沉着、消除局部炎症等 ) ,特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症。在实验中利用血块采用机械破碎法破膜,采用热变性和
2、乙醇氯仿沉淀去除杂蛋白,然后用丙酮沉淀得到粗SOD溶液。关键词:超氧化物歧化酶 分离提取 猪血1前言体内重要的抗氧化酶,广泛分布于各种生物体内。现已证实,在生物体内,SOD具有抗氧化、解毒等重要作用;在体外,具有抗辐射、抗肿瘤及抗衰老、增强人体免疫等功能,广泛用于医药、食品、化妆品等行业,市场广阔。猪血是SOD的重要来源,我国猪血资源十分丰富,具有独特的加工优势。本实验在加热法的基础上用有机溶剂丙酮沉淀超氧化物歧化酶SOD,将SOD从血液中提取出来。2实验目的:2.1了解SOD的生理功能2.2了解SOD的制备方法3实验原理: 超氧化物歧化酶(SOD)是一种金属酶,也是一种蛋白质,可在一定浓度的
3、酸、碱、盐溶液中溶解,又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀,可以利用这一特点,将SOD从血液中提取出来。3.1 加入柠檬酸三钠作为抗凝血剂使用,通过离心机离心,从猪血中分离出红细胞。3.2 利用95%乙醇洗掉DNA,利用氯仿抽提血红蛋白等杂蛋白,再通过离心作用进行离心分离。3.3 利用热变性原理,在随温度的升高和实验操作时间的延长,酶的活性和杂蛋白的含量均呈下降趋势,从比活性上讲猪血中的SOD在55-65变性。变性时间为1526min最适宜,酶纯度最高。3.4 利丙酮作为有机溶剂除杂,离心去沉淀。3.5 在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出
4、02-,生成带色的中间产物,反应开始后先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30-45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义:在25恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。4 实验设备4.1恒温水浴 冰浴器 4.2离心机 4.3布氏漏斗、
5、抽滤瓶 、滤纸 4.4烧杯、量筒、玻璃棒5实验材料及试剂5.1猪血5.2 3.8%(质量分数)柠檬酸三钠 5.3 0.9%(质量分数)氯化钠 5.4 95%(体积分数)乙醇 5.5 氯仿 5.6 丙酮 5.7 pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液5.8 去离子水 、蒸馏水5.9 pH8.2、50mmol/L Tris-HCla.称取Tris0.61g,EDTA-2Na0.037g,用双蒸馏水溶解至80ml左右,用HCl调节pH=8.20(用pH计校正),最后定容至100mL。5.10 10mmol/L HCl5.11 50mmol/L 邻苯三酚 a称取邻苯三酚0.0
6、63g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL,避光保存。6 实验操作步骤6.1分离血球 取新鲜猪血,加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中,新鲜猪血与抗凝液的比例为3:1,轻轻搅拌均匀,4 000r/min离心20min,收集红血球。 6.2除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤,4 000r/min离心20min,重复三次,然后向洗净的红血球加入11.1倍体积去离子水,搅拌溶血30min,再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿,剧烈搅拌15min左右,静置1h,然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀,取清液,过滤,收集滤
7、液。 6.3热变性 上清液加热到65,保温10min,然后迅速冷却到室温,3 000r/min离心20min,弃去沉淀物,收集上清液。 6.4 沉淀清液在盐冰浴中冷却,然后在-5以下的操作温度下,加入1.5倍量预冷丙酮,边加边搅拌均匀,快搅慢加,即有白色沉淀产生, 用4 000r/min离心20min,用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析,即得粗SOD溶液。6.5 邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚(空白管用10mmol/L HCl 代替邻苯三酚),迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定
8、光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07(可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值)。表1试剂空白管(ml)自氧化管(ml)pH8.2、50mmol/L Tris-HCl3310mmol/L HCl0.10.0550mmol/L 邻苯三酚-0.056.6 SOD样液的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚。其余邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。表2试剂空白管(ml)自氧化管(ml)pH8.2、50mmol/L Tris-HCl3310mmol/L HCl0.1-SOD样液-0.0550mmol/L 邻苯三酚-0.057 结果及计算酶活性(U/mL)=(0.070-样液速率)/0.070*100%/50%*反应液总体积*(液稀释倍数/样液体积)8 注意事项8.1 分离血球和血浆宜在15以下。8.2 SOD凝血酶和提取过程中应避免高温影响酶失活。9 费用预算参 考 文 献1 金国华.猪血提取超氧化歧化酶J用科技,1999(9):3.2 李敬玺、刘继兰等.超氧化物歧化酶研究和应用进展J.动物医学进展,2007
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