医学实验常用方法学简介ppt课件

1、研讨技术研讨技术一光学显微镜技术一光学显微镜技术二电子显微镜技术二电子显微镜技术三组织化学术三组织化学术四免疫组织化学术四免疫组织化学术五原位杂交术五原位杂交术六细胞和细胞化学定量术六细胞和细胞化学定量术七组织培育术七组织培育术八放射自显影术八放射自显影术 问问 题题 处理方法处理方法 察看对象太小察看对象太小 放大放大 显微镜显微镜光线不能透过察看对象光线不能透过察看对象 切片切片察看对象缺乏反差察看对象缺乏反差 染色染色察看对象生化成分不同察看对象生化成分不同 细胞化学细胞化学 免疫组织化学免疫组织化学察看对象为生活形状察看对象为生活形状 培育培育一光学显微镜技术一光学显微镜技术1 1、普

2、通光学显微镜、普通光学显微镜2 2、荧光显微镜、荧光显微镜3 3、相差显微镜、相差显微镜4 4、激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描共聚焦显微镜二电子显微镜技术二电子显微镜技术1 1、透射电子显微镜、透射电子显微镜2 2、扫描电子显微镜、扫描电子显微镜三组织化学术三组织化学术1 1、多糖、多糖2 2、脂类、脂类3 3、酶、酶4 4、核酸、核酸四免疫组织化学术四免疫组织化学术五原位杂交术五原位杂交术六细胞和细胞化学定量术六细胞和细胞化学定量术1 1、显微分光光度丈量术、显微分光光度丈量术2 2、形状计量术、形状计量术3 3、流式细胞术、流式细胞术七组织培育术七组织培育术八放射自显影术八放射自显影术一光

3、学显微镜术一光学显微镜术light microscopelight microscopeLMLM1 1 石蜡切片石蜡切片取材取材 Formalin 40%, 4% Formalin 40%, 4%固定固定 Bouin Formalin 40% 25ml Bouin Formalin 40% 25ml 苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75ml 75ml 冰醋酸冰醋酸 5ml 5ml 脱水脱水-乙醇、包埋乙醇、包埋-石蜡石蜡切片切片 6um 6um脱蜡脱蜡 二甲苯二甲苯乙醇乙醇 水水 染色染色 HE Hematoxylin HE Hematoxylin： 核酸核酸RERRER、 Ribosome

4、 Ribosome Eosin Eosin： 蛋白、膜构造蛋白、膜构造mitochondriamitochondria、 SER SER、lysosomelysosome透明、封片透明、封片3 3、涂片、涂片 血涂片血涂片 精液精液 痰液痰液 培育细胞培育细胞4 4、铺片、铺片5 5、磨片、磨片 骨和牙需制成磨片、经染色后察看骨和牙需制成磨片、经染色后察看二电子显微镜技术二电子显微镜技术 电子显微镜简称电镜的发明和运用，使组织电子显微镜简称电镜的发明和运用，使组织胚胎学研讨内容发生了深化变化。光镜分辨率为胚胎学研讨内容发生了深化变化。光镜分辨率为0.2um，放大倍数约为，放大倍数约为1000倍

5、，而电镜的分辨率为倍，而电镜的分辨率为0.2nm，比光镜高，比光镜高1000倍，可放大几万倍至几十万倍，可放大几万倍至几十万倍，因此电镜能察看到更微细的构造。在电镜下所倍，因此电镜能察看到更微细的构造。在电镜下所见的构造称为超微构造见的构造称为超微构造(ultrastructure)。 用于察看细胞内部构造，标本制备比光用于察看细胞内部构造，标本制备比光镜的要求更严厉，组织块要更新颖，体积更镜的要求更严厉，组织块要更新颖，体积更小小1mm3，固定常用戊二醛和锇酸。切片，固定常用戊二醛和锇酸。切片那么用超薄切片机，制成那么用超薄切片机，制成5080nm的超薄切的超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，

6、然后在电镜片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下察看并摄片。下察看并摄片。1、透射电镜、透射电镜transmission electron microscope 用于察看组织或细胞外表的微细构造，标用于察看组织或细胞外表的微细构造，标本需经喷镀金属膜特殊处置，然后在扫描电镜本需经喷镀金属膜特殊处置，然后在扫描电镜下察看，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体下察看，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体感的外表图像，如细胞外表的微绒毛、纤毛和感的外表图像，如细胞外表的微绒毛、纤毛和细胞伸出的伪足等。细胞伸出的伪足等。2、扫描电镜、扫描电镜scanning electron microscope)2 2、

7、冰冻切片、冰冻切片 组织置入液氮组织置入液氮-196-196快速冻结，恒冷切快速冻结，恒冷切 片机切片、染色。片机切片、染色。 更好保管细胞内酶的活性、蛋白质构造。更好保管细胞内酶的活性、蛋白质构造。 缺陷：组织片厚，经冷冻后易破坏组织构造缺陷：组织片厚，经冷冻后易破坏组织构造2 2、荧光显微镜、荧光显微镜fluorescence fluorescence microscopemicroscope 由光源、滤光系统和显微镜三个部分由光源、滤光系统和显微镜三个部分组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或标本中的自发荧光物质或经荧

8、光素染色或标志的构造在紫外光激发下可产生各种颜标志的构造在紫外光激发下可产生各种颜色的荧光，以此来研讨该荧光物质在细胞色的荧光，以此来研讨该荧光物质在细胞和组织中的分布。和组织中的分布。3 3、相差显微镜、相差显微镜phase contrast phase contrast microscopemicroscope 用于进展细胞培育中活细胞的察看，用于进展细胞培育中活细胞的察看，可使无色透明的细胞镜下构造反差明显，图可使无色透明的细胞镜下构造反差明显，图像明晰。像明晰。4 4、激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描共聚焦显微镜laser scanning confocal laser scanning

9、 confocal microscopemicroscope 是近年研制和运用的一种新型显微镜。它将激是近年研制和运用的一种新型显微镜。它将激光束落在样品上，并作挪动扫描，对样品内某种荧光标光束落在样品上，并作挪动扫描，对样品内某种荧光标志的物质进展二维和三维的动态微量分析测定。可用来志的物质进展二维和三维的动态微量分析测定。可用来研讨活细胞内研讨活细胞内Ca2Ca2、 Na+Na+和和 K+K+等等pHpH值的动态变化；细胞值的动态变化；细胞内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传送的检测；位和定

10、量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传送的检测；利用激光对细胞构造或染色体作切割、分别和克隆等逐利用激光对细胞构造或染色体作切割、分别和克隆等逐渐成为生物医学研讨中重要的研讨手段。渐成为生物医学研讨中重要的研讨手段。三组织化学术三组织化学术histochemistry 运用化学反响与物理反响原理检运用化学反响与物理反响原理检测组织或细胞内某种化学成分并进展测组织或细胞内某种化学成分并进展定位、定量及相关功能研讨的技术。定位、定量及相关功能研讨的技术。1、多糖、多糖 显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸酸雪夫反响雪夫反响(periodic acid Schiff r

11、eaction,PAS反响反响)。组织或细胞中的多糖被。组织或细胞中的多糖被结合构成紫红色沉淀物。此反响称结合构成紫红色沉淀物。此反响称PAS阳性反阳性反响，响，PAS阳性部位为多糖存在部位。阳性部位为多糖存在部位。2 2、脂类、脂类 标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。3 3、酶、酶 酶细胞化学反响的根本原理是利酶细胞化学反响的根本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧

12、化等作用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，使底物的反响产物被某种捕获剂用，使底物的反响产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀，构成有色的终产捕获并在原位沉淀，构成有色的终产物，借此测定该酶在细胞内的分布及物，借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。活性强弱。4、核酸、核酸 显示显示DNA的传统方法是的传统方法是Feulgen反响反响Feulgen reaction，组织切片或细胞涂片先，组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处置，使经稀盐酸处置，使DNA水解，醛基暴露，再用水解，醛基暴露，再用雪夫试剂处置，构成紫红色反响产物。雪夫试剂处置，构成紫红色反响产物。四免疫组织化学术四免疫组织化学术immunohist

13、ochemistry 利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进展的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进展抗体标志；用荧光素如异硫氰酸荧光素标志，可抗体标志；用荧光素如异硫氰酸荧光素标志，可以在荧光显微镜下察看，用胶体金标志，可以在以在荧光显微镜下察看，用胶体金标志，可以在电镜下察看，用辣根过氧化酶标志，那么可在光电镜下察看，用辣根过氧化酶标志，那么可在光镜下或在电镜下察看。常用的方法有直接法、间镜下或在电镜下察看。常用的方法有直接法、

14、间接法和亲和素接法和亲和素-生物素复合物法生物素复合物法ABC法等。法等。荧光的察看按标本分类荧光的察看按标本分类 在荧光显微镜下察看的标本，当然在荧光显微镜下察看的标本，当然必需发出荧光，可是大多数标本本身不必需发出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因此必需用荧光色素处置能发出荧光，因此必需用荧光色素处置过才干发出荧光。过才干发出荧光。A A自发荧光自发荧光B B二次荧光二次荧光C C抗体荧光技术抗体荧光技术A A自发荧光不加染色自发荧光不加染色 有些物质不加染色，也能发出荧光自发有些物质不加染色，也能发出荧光自发荧光或原发荧光，但在医学和生物学细胞荧光或原发荧光，但在医学和生物学细胞学

15、、生物组织、培育体等领域中，只需很少学、生物组织、培育体等领域中，只需很少物质具有自发荧光，常采用后两种方法。物质具有自发荧光，常采用后两种方法。 测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以断定物质性质荧光光度法。断定物质性质荧光光度法。 运用：生物学方面运用：生物学方面断定维生素，研讨断定维生素，研讨生物学上的生物源的胺。生物学上的生物源的胺。B B二次荧光用化学染色二次荧光用化学染色 非荧光性的物质蛋白质、炭水化合物等非荧光性的物质蛋白质、炭水化合物等用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光二次荧用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光二次荧光，以便进展察看，对特定物体选

16、择适宜的荧光，以便进展察看，对特定物体选择适宜的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别分别出来而可以察看到。分别出来而可以察看到。 运用：吖啶橙运用：吖啶橙+ +核酸核酸 金胺金胺+ +结核菌结核菌 介子奎二噁因介子奎二噁因+ +染色体染色体C C抗体荧光技术用免疫染色抗体荧光技术用免疫染色 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个现实，有认识地使带荧光标志的抗体和标本一个现实，有认识地使带荧光标志的抗体和标本中的抗原进展抗原中的抗原进展抗原/ /抗体反响，这样两者的结合抗体反响，这样两者的结合体就能经过抗体的

17、荧光察看到。荧光显微镜最常体就能经过抗体的荧光察看到。荧光显微镜最常用于抗体荥光技术进展察看，并成为医学、生物用于抗体荥光技术进展察看，并成为医学、生物学很多领域中极为有用的工具。学很多领域中极为有用的工具。Glial fibrillary acidic protein荧光色素荧光色素+ +物质物质 激发方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光自发荧光自发荧光维生素维生素A A 紫外紫外UVUV 325-345nm 470-490nm325-345nm 470-490nm维生素维生素B6 B6 紫外紫外UVUV 356 432 356 432 儿茶酚胺儿茶酚胺 紫紫V V 410410

18、405-415405-415 480480475-485475-485血清素血清素5-5-羟色胺羟色胺 紫紫V V 390390385-400385-400 530530520-540520-540叶绿素叶绿素 兰兰B B 520 650-660520 650-660荧光色素荧光色素+ +物质物质 激发方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光二次荧光二次荧光芥子奎二噁因芥子奎二噁因 兰紫兰紫BVBV 450 450 500500四环素四环素+ +骨，牙骨，牙 紫紫V V或兰或兰B B 390 390 560560吖啶橙吖啶橙+DNA +DNA 兰兰B B 460 460 530530吖

19、啶橙吖啶橙+RNA +RNA 兰兰B B 460 460 650650金胺金胺+ +结核菌结核菌 兰兰G G 470 470 557557福尔根反响福尔根反响+DNA +DNA 绿绿G G 550 550 650650溴化乙啶溴化乙啶EBEB+DNA +DNA 绿绿G G 545 545 605605Propidium IodidePropidium IodidePIPI+DNA +DNA 绿绿G G 530 530 615615DAPI+A-T DAPI+A-T 紫外紫外U U 372 372 456456Mithramycin+G-C Mithramycin+G-C 兰紫兰紫BVBV 39

20、5 395 570570Olivomycin+G-C Olivomycin+G-C 兰紫兰紫BVBV 430 430 545545 荧光色素荧光色素+ +物质物质 激发方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光抗体荧光技术抗体荧光技术 FITC FITC 兰兰B B 495 525495 525TRITC TRITC 绿绿G G 555 580555 580罗达明罗达明RhodamineRhodamine 绿绿G G 568 597568 597尼罗红尼罗红+ +溶酶体溶酶体 兰，绿兰，绿B B、G G 485-530 525-605485-530 525-605派假设宁丫派假设宁丫+

21、+线粒体线粒体 绿绿G G 540 470540 470五原位杂交术五原位杂交术in situ hybridization 经过检测细胞内经过检测细胞内mRNA和和DNA分子序列片段，分子序列片段，原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。运用某种知的并被标志的运用某种知的并被标志的RNA或或DNA片段即核酸片段即核酸探针探针cRNA或或cDNA，与细胞内的待测核酸，与细胞内的待测核酸RNA或或DNA片段进展杂交，经过标志物的显片段进展杂交，经过标志物的显示在光镜和或电镜下察看目的示在光镜和或电镜下察看目的mRNA或或DNA的存在与定位。的存在与定

22、位。标志胰岛素标志胰岛素cRNA探针，示胰岛素探针，示胰岛素mRNA阳性阳性六细胞和细胞化学定量术六细胞和细胞化学定量术1 1、显微分光光度丈量术、显微分光光度丈量术2 2、形状计量术、形状计量术3 3、流式细胞术、流式细胞术1、显微分光光度丈量术、显微分光光度丈量术microspectrophotometry 运用显微光光度计，以物质分子对光波的选择运用显微光光度计，以物质分子对光波的选择性吸收为根底，在显微镜下对生物样品中的化学物性吸收为根底，在显微镜下对生物样品中的化学物质进展定量分析。质进展定量分析。2、形状计量术、形状计量术morphometry 运用几何学和统计学原理，对组运用几何

23、学和统计学原理，对组织或细胞进展二维和三维的形状丈量织或细胞进展二维和三维的形状丈量研讨，如对细胞的数量、体积、外表研讨，如对细胞的数量、体积、外表积和周长的相对和绝对值的丈量等。积和周长的相对和绝对值的丈量等。3、流式细胞术、流式细胞术flow cytometry 是近年开展起来的细胞分类和定量研讨技术，能对是近年开展起来的细胞分类和定量研讨技术，能对细胞的生物化学和生物物理特性进展快速定量测定，还细胞的生物化学和生物物理特性进展快速定量测定，还可分选搜集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免可分选搜集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免疫学、血液学和肿瘤学等的研讨提供了重要的研讨手段。疫学、血液学和肿瘤学等的研讨提供了重要的研讨手段。如细胞周期各时相细胞的比例，同步分析细胞内如细胞周期各时相细胞的比例，同步分析细胞内DNA、RNA和蛋白质的含量，和蛋白质的含量，T淋巴细胞亚群的分别和定量，淋巴细胞亚群的分别和定量，淋巴细