JS-YZ-15需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案

1、需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案编码js-yz-15版本00版制定人日期2015年3月14日审核人日期2015年3月15日批准人日期2015年3月16日实施日期2015年3月17日总页数共10页目录_、验证概述二验证目的三、验证方案适用范围四、参考文献五、验证组织职责及培训确认六、验证内容七、异常情况处理程序八、再验证周期九、验证结果评定与结论 十、附件1验证概述微生物限度检查法是用于非规定灭菌制剂、原辅料及其原辅料受微生物污染程度的方 法。检查项目包括能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌。当建立产品的微生物限度检查法 时，应进行微生物的计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物

2、计数。若 检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。2验证目的(1 )确认采用薄膜过滤法计数的方法适用于微生物限度检查微生物计数测定。(2 )验证过程应严格按照本方案规定内容进行，若因特殊原因确需变更时，应验证方案修改申请及批准书(附录2)，报验证领导小组批准。3验证方案适用范e本方案适用于微生物限度检查微生物计数方法验证的全过程。4参考文献中华人民共和国药典s. 2015年版5验证组织职责根据验证管理制度(文件编码：sjsw/zd-45 )的规定，成立验证工作小组，其组员如表1所示：表1 验证小组成员表验证组组长姓名职务部门张成雄经理质量部成员姓名职务部门工程师技术部生产

3、主任生产部设备部检验员质量部检验员质量部5.1验证小组的职责如下：5.1.1企业质量负责人5.1.1.1负责验证方案的批准，验证合格证的签发。5.1.1.2参与验证立项会议及最终验证评审会议，提供各种建议和意见。5.1.2验证小组组长5.1.2.1负责组织验证小组，起草验证方案。5.1.2.2负责对验证小组成员进行培训。5.1.2.3负责组织验证的实施，处理验证过程中出现的异常情况，必要时向企 业质量负责人汇报。5.1.2.4负责撰写验证总结和报告。5.1.3验证小组成员5.1.3.1负责验证工作的实施，收集验证数据，填写各项验证记录。5.1.3.2负责确认验证过程中所使用的各种计量器具在有效

4、期内，各种设备处 于正常的有效的运行状态，且得到验证。5.1.4验证协调员5.1.4.1验证协调员由质量管理部门的质量管理人员担任。5.1.4.2验证协调员负责所参与的验证项目的质量管理过程的跟踪、信息搜集 反馈等工作。5.1.4.3验证协调员负责验证过程中验证小组与公司内部其他未参与验证工作 的部门的相关工作的沟通和协调。6验证内容6.1验证过程所需的设备、仪器/仪表，其中仪器/仪表须说明其检定/校准或验证信息，确认是否满足验证要求。验证所涉及的设备、仪器/仪表如表2所示。表2验证所需设备、仪器/仪表序号仪器/仪表名称制造商规格型号是否在有效期备注1生化培养箱上海跃进医疗器械有限公司spx-

5、802手提式压力蒸汽 灭菌器嘉兴市中新医疗仪器有限公司yxq-280sd3生物安全柜6.2实验中所有试剂6.2.1验证用培养基：验证过程中所使用的培养基信息如表3所示表3 验证用培养基名称生产厂商批号胰酪大豆月东琼脂培养基自行配制沙氏葡萄糖琼脂培养基自行配制6.3验证方法6.3.1菌液的制备6.3.1.1按表4规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞肝、枯草芽抱杆菌、白色念球菌的新鲜培养物，用ph7.0无菌氯化钠蛋白豚缓冲液或0.9%r=i化钠溶液制成约100cfu/ml的菌悬液。6.3.1.2取黑曲霉菌的新鲜培养物，加入3-5ml含0.05% （ ml/ml ）聚山梨脂80的0.

6、9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。然后，用适宜方法吸出抱子悬液至无菌试管内，用含0.05% （ ml/ml ）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成约100cfu/ml的黑曲霉电子悬液。6.3.2接种和稀释：验证用菌株：验证用菌株（不大于第5代）如表4所示。试验分为三组，进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值。表4验证用菌株验证菌株培养基金黄色葡萄球菌胰酪大豆月东琼脂培养基铜绿假单胞菌胰酪大豆腺琼脂培养基枯草芽抱杆菌胰酪大豆籐琼脂培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉菌沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度（°c ）培养时间（小

7、时）30-3548-2430-3518-2430-3518-2420-2548-7220-25120-1686.3.2.1试验组：取纯化水原液1ml ,加入试验菌液1ml，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于wocfuo6.3.2.2供试品对照组：取纯化水原液2ml ,同试验组操作。6.3.2.3菌液对照组：取试验菌液2ml ,同试验组操作。倒置培养。每种计6.3.2.4阴性对照试验：取无菌平皿，注入培养基，凝数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。6.3.3供试品中微生物回收6.3.3.1平皿法包括倾注法和涂布法。每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。倾注法:取照

8、上述“供试液的准备”“接种和稀释”制备的供试液1ml ,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过459熔化的胰酪大豆籐琼脂培养基或沙氏 葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应 增加。需氧菌置30-35°c下培养72小时，计数。霉菌和酵母菌置20-25°c下培养120小 时，计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数，计算各试验组的平均菌落数。涂布法:取15-20ml温度不超过459熔化的胰酪大豆月东琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表 面干燥。每一平板表

9、面接种上述照“供试液的准备”“接种和稀释”制备的供试液不少于1ml ,需氧菌置30-35°c下培养72小时，计数。霉菌和酵母菌置20-25°c下培养120小时，计 数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数，计算各试验组的平均菌落数。6.4.2薄膜过滤法滤膜直径一般为50mm ,孔径不大于0.45pm ,滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。取1ml的供试品过滤，若测定需氧 曲总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆月东琼脂培养基平板上，置30-35°c下培养72小 时，计数。；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂

10、培养基平板 上，置20-25°c下培养120小时，计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。6.5结果判断：在3次独立的平行试验中，若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组落数的比值在0.5-2范围内，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的 需氧菌、霉菌及酵母菌数。6.6验证结果：计数结果填报于微生物计数方法验证记录（见附件3 ）7异常情况处理程序验证过程中，应严格按照标准操作规程、质量标准进行操作和判定。岀现个别项目不符 合标准的结果时，应按下列程序进行处理：7.1重新抽取样品进行检测。7.2若属于方案设定的原因，必要时报验证小组，填写异常情况处理表（见附件1 ）,若

11、有需要，可填写风险分析报告并逐级递交，或提交验证方案修改申请及批准 书（见附件2）并逐级递交。8再验证周期8.1更换检验程序或计数方法应重新验证。8.2检测产品发生变化应重新验证。8.3每年应对检验方法进行再验证9验证结果评定与结论小组成员负责收集各项验证结果记录，报验证小组，验证组长负责对验证结果进行综合 评审，做出验证结论，填写验证结果审批记录表。满足验证目的发放验证合格证（见附 件4 ）。附件1异常情况处理表验证编号事件编号事件描述：发生部门签字：日期：年月日事件处理影响等级轻度的严重的致命的灾难的纠偏措施描述执行人/部门：计划完成时间：调查部门 签名/日期部门1部门2部门3部门4部门5纠偏措施复测/复查结果结论 p/cf检查人/日期：qa确认/日期：批准人/日期附件2验证方案修改申请及批准书验证方案 名称验证方案编号修改内容修改原因 及依据修改后方案起草人部门负责人年 月曰验证 小组审批验证小组组长：年 月 日附件3需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法验证的测定结果（cfu）实验开始时间年 月 日实验结束时间年 月曰菌类试验用菌种测定项目试验组菌液组供试品对照组阴性对照