分子生物学实验思考题答案

1、学习必备欢迎下载分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA 的提取1、为什么构建DNA 文库时，一定要用大分子DNA?答、 文库 的大小 (即数目 )取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99% 甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆 尽量大的DNA 片段 .2 、如何检测和保证DNA 的质量？答、用 凝胶电泳 看，有没有质白质和RNA 等物质的污染，还可以测OD ，用 OD260/280来判断，当 OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高当 OD260/OD280> 2.0，表示R

2、NA 含量较高当 OD260/OD280=1.8 2.0 ，表示 DNA较纯。实验二、植物总RNA的提取1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？答、 有 DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，藻土等；在总RNA 提取中用PEPC,TrizolRNA酶的蛋白抑制剂以及SDS ，尿素，硅2、怎样从总 RNA中进行 mRNA的分离和纯化。答、利用成熟的 mRNA 的末端具有 polyA 尾的特点合成一段 oligo(dT) 的引物，根据碱基互补配对原则，可将 mRNA 从总 RNA 中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？

3、答、A ）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于 4的培养菌，最好从 - 80甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞 的菌液。细胞生长密度以刚进入 对数生长期 时为宜，可通过监测培养液的 OD600 来控制。DH5 菌株的 OD600 为 0.5 时，细胞密度在 5 × 107 个/mL 左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。C）经 CaCl2 处理的细胞， 在低温条件下， 一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24 小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于

4、总的活菌数随时间延长而减少造成的）D ）化合物及 无机离子 的影响：在 Ca2+ 的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+Co2+ ）、 DMSO 或还原剂 等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂 或其它化学物质的存在可能大大降低细菌；或的转化效率；2 、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？答、在基因工程 中将 质粒 导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+ 处理变为 感受态细胞 质粒进入。实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定1 、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？答、 活化培养用的一般是SOC培养

5、基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让 大肠杆菌 迅速复苏， 恢复分裂活性， 此时的细胞还不具抗性，加入抗生素 会细胞会死亡。2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？学习必备欢迎下载答、 质粒是细菌体内的环状DNA 分子 。质粒 也是作为细菌遗传载体的一部分，但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内 DNA 的小很多。比如， 抗性基因 ，荧光蛋白 基因等等。根据 质粒随细胞分裂 而分裂的次数， 将其分为两类： 一类是 严紧型质粒 ，当细胞 染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1 2 个质粒；另一类是松弛型质粒 ，当

6、 染色体 复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。常用于 基因重组 的质粒是pBR322 质粒，因为其基因 测序已经完成， 而且它携带了两个标记基因 ，一个是 氨苄青霉素抗性基因Apr ，另一个是 四环素抗性基因Tetr。实验六、质粒DNA的分离纯化和鉴定1、在实验过程中，加入的EDTA 、SDS 分别起什么作用?答、 EDTA可以结合 DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解细菌和沉淀蛋白。2、乙酸钾在实验过程中主要起什么作用?答、主要是在分离过程中起着中和 PH的作用， DNA经碱（ NaoH) 裂解后，染色体 DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒 DNA氢键断裂，互补

7、链不能完全分离，再经乙酸钾中和成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。3、氯仿在核酸的提取过程中有何作用？答、克服酚的特点，加速有机层和液相的分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中迹量酚。4、本实验整个过程中应该注意些什么？答、 1 、提取过程应尽量保持低温；2 、提取质粒 DNA 过程中除去蛋白质很重要， 采用酚、 氯仿去除蛋白质要比单独用酚或者氯仿要好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3 、沉淀 DNA一般使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可以使沉淀完全。沉淀 DNA也可以使用异丙醇（一般使用等体积 ), 且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀，所以多数还是用乙醇。实验七、聚合酶链式反应一般原理和

8、技术1、降低退火温度对反应有何影响？答、变性所需的加热温度取决于模板及 PCR 产物双链 DNA 中的 G+C 含量。 双链 DNA 中的 G+C 的比率越高，则双链 DNA 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与 DNA 分子的长度 相关， DNA 分子越长， 在特定的变性温度下使双链 DNA 分子完全分离所需的时间就越长。 若变性温度太低或变性时间太短，则只能使 DNA 模板中富含 AT 的区域产生变性，当 PCR 循环中的反应温度降低时， 部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致PCR 的失败。非特异性条带数增多。2、 PCR 循环次数是否越多越好？为何?答、循环次数

9、越多，非特异性产物的量亦随之增多。3、 PCR技术可应用与哪些方面？举例。答、 1 、核酸的基础研究：基因组克隆2 、不对称 PCR制备 单链 DNA 用于 DNA 测序3 、反向 PCR 测定未知 DNA 区域4 、反转录 PCR（ RT-PCR ）用于检测细胞中基因表达水平、RNA 病毒量以及直接克隆特定基因的 cDNA5 、荧光定量 PCR用于对 PCR 产物实时监控6 、 cDNA 末端快速扩增技术7 、检测基因的表达学习必备欢迎下载8 、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学实验八、 DNA 的限制性内切酶酶切和鉴定1 、写出 ECORI 和 Hind3两种内切酶消化产物的末端序列。答、GAATTC EcoRI的识别序列和切割位点，粘性末端 即：AATTC- CTTAAG G-Hind的识别序列为：AA GCTT“ ”为切割位点， 黏性末端 为： AGCTT- A-2 、什