细胞生物学研究方法学时学习教案

1、会计学1第一页，共50页。第1页/共50页第二页，共50页。 显微镜显微镜电子显微镜电子显微镜复式显微镜复式显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光学显微镜光学显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜 研究用显微镜研究用显微镜单式显微镜单式显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜第2页/共50页第三页，共50页。对任何显微镜来说，最重要对任何显微镜来说，最重要(zhngyo)的性能的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。参数是分辨率，而不是放大倍数。第3页/共50页第四页，共5

2、0页。普通普通(ptng)光镜的最大光镜的最大分辨率是分辨率是0.2m。0.2um0.2um0.2nm0.2nm0.1nm0.1nm第4页/共50页第五页，共50页。1 1、普通、普通(ptng)(ptng)光学光学显微镜显微镜 light microscopelight microscope第5页/共50页第六页，共50页。 将透过标本的可见光的光程差变成振幅将透过标本的可见光的光程差变成振幅(zhnf)差，差，提高对比度，构造上的特殊之处：提高对比度，构造上的特殊之处：环形光阑（环形光阑（condenser annulus）相位板（相位板（annular phase plate） 用途：可

3、以观察未经染色的标本和活细胞用途：可以观察未经染色的标本和活细胞第6页/共50页第七页，共50页。F. Zernike于于1935年发明年发明(fmng)并因并因此获此获1953年诺年诺贝尔物理奖贝尔物理奖第7页/共50页第八页，共50页。物镜与照明物镜与照明(zhomng)系统系统颠倒，前者在载物台之下，颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，可以用后者在载物台之上，可以用于观察培养皿中的活细胞。于观察培养皿中的活细胞。第8页/共50页第九页，共50页。在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗振光的干涉，加强影像的明暗(mn

4、 n)效果，效果，能显示结构的三维立体投影。与相差显微镜相能显示结构的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强比，立体感更强第9页/共50页第十页，共50页。为落射式照明，即光源通过为落射式照明，即光源通过(tnggu)物镜投射于物镜投射于样品样品光源为波长较短的光，分辨力强光源为波长较短的光，分辨力强用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光第10页/共50页第十一页，共50页。兼有明视野、相差、微兼有明视野、相差、微分干涉、荧光、显微摄分干涉、荧光、显微摄影等功能，是高级影等功能，是高级(goj)研究仪器。研究仪器。第11页/共50页第十二页，共50

5、页。第12页/共50页第十三页，共50页。Epi-fluoresceneConfocal荧光显微镜与扫描荧光显微镜与扫描(somio)共焦显微镜的比较（小鼠肾共焦显微镜的比较（小鼠肾小球）小球）Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin, a green-fluorescent lectin, was used to label elements of the glomeruli and convoluted tubules. The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush border we

6、re stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin. The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI. Molecular Probes FluoCells prepared slide #3 (F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30 OilZeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr第13页/共50页第十四页，共50页。荧光荧光(ynggung)观观察细胞结构察细胞结构细胞内

7、的动态变化细胞内的动态变化FRETFRP第14页/共50页第十五页，共50页。鲁斯卡鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，德国物理学家，1932年研制年研制第一台电子显微镜，第一台电子显微镜，1986年获诺贝尔物理奖。年获诺贝尔物理奖。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)(jsh) Electron microscopy Electron microscopy第15页/共50页第十六页，共50页。 1 1、光镜与电镜的主要、光镜与电镜的主要(zhyo)(zhyo)区别区别（1）光源不同）光源不同: 可见光可见光/紫外线紫外线-电子束电子束 （2）透镜不同）透镜不同: 玻璃玻璃(b

8、 l)-电磁透镜电磁透镜 （3）真空）真空 （4）显示记录系统）显示记录系统 （5）分辨率）分辨率: 0.2 um -0.2 nm第16页/共50页第十七页，共50页。1、透射、透射(tu sh)电子显微镜电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 透射式电子显微镜用于观察透射式电子显微镜用于观察(gunch)小于小于0.2m的细微结构，称为亚显微结构（的细微结构，称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（）或超微结构（ultramicroscopic structures）.Figure 3-20. Elect

9、ron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. 第17页/共50页第十八页，共50页。超薄切片超薄切片(qi pin)制样技术制样技术取材取材固定固定脱水脱水(tu shu)渗透、包埋渗透、包埋超薄切片超薄切片 厚度厚度40-50nm染色染色电镜的实际电镜的实际(shj)分辨率与切片厚度分辨率与切片厚度有关有关第18页/共50页第十九页，共50页。Figure 3-29. Electron micrograph of negatively stained actin filame

10、nts. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) 第19页/共50页第二十页，共50页。冷冻冷冻(lngdng)蚀刻电镜技术蚀刻电镜技术 Freeze Etching electron microscopy第20页/共50页第二十一页，共50页。20世纪世纪60年代问世，用来观察标本年代问世，用来观察标本(bi

11、obn)的表面结构的表面结构目前扫描电镜的分辨力为目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。第21页/共50页第二十二页，共50页。Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast

12、 light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).第22页/共50页第二十三页，共50页。Binnig和和Rohere 1981年发明年发明(fmng)，1986年获奖；年获奖；可观察到原子级的图像。可观察到原子级的图像。第23页/共50页第二十四页，共50页。A.X-ray crystallographyB. X射线衍射射线衍射(ynsh)B. NMR spectroscopy核磁共振核磁共振(h c n zhn)成像成像第24页/共50页第二十五页，共50页。普通普通(ptng)离心机：转速离心机：转速250

13、00 r/min超速离心机：超速离心机：30000 r/min第25页/共50页第二十六页，共50页。 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同用于分离不同(b tn)大小的细胞和细胞器大小的细胞和细胞器 。细胞器沉降细胞器沉降(chnjing)顺序：核顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体。酶体、内质网与高基体。第26页/共50页第二十七页，共50页。 用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，通过离度，细胞混悬液或匀浆置于介质

14、顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。心力场的作用使细胞分层、分离。 常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖 分为速度分为速度(sd)沉降（沉降（velocity sedimentation）和等密度沉降（和等密度沉降（equilibrium sedimentation） 。第27页/共50页第二十八页，共50页。柱色谱(s p)亲和色谱第28页/共50页第二十九页，共50页。Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Figure 3-44. Separation of prote

15、in molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.第29页/共50页第三十页，共50页。二、细胞内核酸二、细胞内核酸(h sun)(h sun)、蛋白质、糖、蛋白质、糖等成分的显示方法等成分的显示方法为了对某些为了对某些(mu xi)细胞成分进行定性和定位研究，细胞成分进行定性和定位研究，利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理加以显示，称为组织化学和细胞化学染色方法理加以显示，称为组织化学和细

16、胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）；）；如：细胞内如：细胞内DNA和和RNA的原位显示的原位显示 第30页/共50页第三十一页，共50页。Myofibrillar ATPase: Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀(h p)脱氢酶): Identifying Oxidati ve Potential Promoter:GUS第31页/共50页第三十二页，共50页。是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，是根据免疫学原理，利用抗体同特

17、定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物有荧光对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物有荧光(ynggung)素和酶素和酶免疫荧光免疫荧光(ynggung)法（法（immunofluorescent technique）酶标免疫法（酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）二、细胞(xbo)内特异蛋白质的定位和定性第32页/共50页第三十三页，共50页。免疫荧光法免疫荧光法酶标免疫酶标免疫(miny)法法第33页/共50页第三十四页，共50页。四、细胞内特异核酸序列(xli)的定位和定性原位杂交（in situ hybridization）人类人类(

18、rnli)(rnli)染色体端染色体端粒粒DNADNA的荧光原位杂交的荧光原位杂交照片照片果蝇果蝇HBHB基因表达的原基因表达的原位杂交照片位杂交照片第34页/共50页第三十五页，共50页。 对单个细胞进行对单个细胞进行(jnxng)快速定量快速定量分析分选的一门分析分选的一门技术；技术；第35页/共50页第三十六页，共50页。 活体或在体活体或在体(in vivo ) (in vivo ) 离体或体外离体或体外(in vitro ) (in vitro ) 细胞培养细胞培养 (cell culture) (cell culture) 就是就是(jish)(jish)选用选用最佳生存条件对活细

19、胞进行培养和研究的技术；最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术；第36页/共50页第三十七页，共50页。 原代培养原代培养 (primary culture)：从动物机体取出：从动物机体取出进行培养的细胞群。进行培养的细胞群。 传代培养传代培养 (passage)：将细胞从一个培养瓶转：将细胞从一个培养瓶转移移(zhuny)到另外一个培养瓶即称为传代或到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。传代培养。 细胞株细胞株 (cell strain) 和细胞系和细胞系(cell line)第37页/共50页第三十八页，共50页。组织培养组织培养 (tissue culture)：诱发产生：诱发产生(c

20、hnshng)愈愈伤组织，诱导再分化可培养出再生植株伤组织，诱导再分化可培养出再生植株 单倍体培养单倍体培养(haploid culture )：花药或花粉培养获：花药或花粉培养获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体原生质体培养原生质体培养(protoplast culture)：第38页/共50页第三十九页，共50页。 两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合程称为细胞融合 (cell fusion)或细胞杂交或细胞杂交 (cell hybridization) 基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异核体；因型的杂交细胞称为异核体； 诱导方法诱导方法(fngf)：生物：生物(病毒病毒)、化学、化学(PEG)、物、物理理(电激、激光电激、激