《酶动力学分析》ppt课件

1、 酶动力学分析 酶促反响动力学酶促反响动力学n学习目的：学习目的：n1 1、了解酶促反响特点及与普通化学反响的区别。、了解酶促反响特点及与普通化学反响的区别。n2 2、掌握、掌握0 0、1 1级和米氏酶促反响动力学及运用原理；级和米氏酶促反响动力学及运用原理；n3 3、了解存在抑制时的酶促反响动力学特征；、了解存在抑制时的酶促反响动力学特征；n4 4、具备固定化酶反响中的过程分析才干和内外不同、具备固定化酶反响中的过程分析才干和内外不同阶段的固定化酶动力学的运用才干；阶段的固定化酶动力学的运用才干；n5 5、熟习酶的失活动力学与反响过程中酶失活动力学、熟习酶的失活动力学与反响过程中酶失活动力学

2、行为。行为。酶促反响动力学酶促反响动力学n第一节第一节 均相酶促反响动力学均相酶促反响动力学n第二节第二节 固定化酶促反响动力学固定化酶促反响动力学n第三节第三节 酶的失活动力学酶的失活动力学酶促反响酶促反响Enzymatic reactionEnzymatic reaction：研讨酶促反响研讨酶促反响研讨生物反响的根底研讨生物反响的根底酶促反响动力学酶促反响动力学酶催化反响机制酶催化反响机制对酶促反响速率的规律对酶促反响速率的规律进展定性或定量的描画进展定性或定量的描画建立反响动力学方程建立反响动力学方程确定适宜的操作条件确定适宜的操作条件酶促反响特征酶促反响特征n优点：优点：n反响在常温

3、、常压、反响在常温、常压、中性中性pH范围进展，范围进展，节能且效率高。节能且效率高。n反响专注性强，副反响专注性强，副产物生成少；产物生成少；n反响体系简单，反反响体系简单，反响最适条件易于控响最适条件易于控制。制。n缺乏：缺乏：n反响仅限少数步骤，反响仅限少数步骤，经济性差；经济性差；n反响周期较长；反响周期较长；第一节第一节 均相酶促反响动力学均相酶促反响动力学n一、酶促反响动力学根底一、酶促反响动力学根底n二、单底物酶促反响动力学二、单底物酶促反响动力学n 1 1、米氏方程、米氏方程n 2 2、操作参数对酶促反响的影响、操作参数对酶促反响的影响n 3 3、抑制剂对酶促反响速率的影响、抑

4、制剂对酶促反响速率的影响n三、多底物酶促反响动力学三、多底物酶促反响动力学 n均相酶催化反响均相酶催化反响: n 指酶与反响物系同处液相的酶催指酶与反响物系同处液相的酶催化反响化反响. 因此不存在相间的物质传送因此不存在相间的物质传送.n均相酶催化反响动力学所描画的反响均相酶催化反响动力学所描画的反响速率与反响物系的根本关系速率与反响物系的根本关系,反映了该反映了该反响过程的本征动力学关系反响过程的本征动力学关系,而且酶与而且酶与反响物的反响是分子程度上的反响反响物的反响是分子程度上的反响.一、酶促反响动力学根底一、酶促反响动力学根底影响酶促反响的要素：影响酶促反响的要素：浓度：浓度：酶浓度酶

5、浓度底物浓度底物浓度外部要素环境要素：外部要素环境要素：溶液的介电常数溶液的介电常数与离子强度与离子强度压力压力温度温度pH值值内部要素构造要素：内部要素构造要素：底物浓度及效应物底物浓度及效应物酶构造酶构造产物浓度产物浓度n零级反响零级反响n 酶促反响速率与底物浓度无关。酶促反响速率与底物浓度无关。max d Srdt式中：式中：S底物浓度；底物浓度； rmax最大反响速率。最大反响速率。3-1n一级反响一级反响n酶促反响速率与底物浓度的一次方成正酶促反响速率与底物浓度的一次方成正比。比。n 酶催化酶催化AB的反响的反响10()dbk abdt式中：式中： 一级反响速率常数；一级反响速率常数

6、； 底物底物A的初始浓度；的初始浓度； bt时产物时产物B的浓度。的浓度。1k0a3-2n二级反响二级反响n 酶催化酶催化A+BC的反响的反响200()()dck ac bcdt式中：式中： 二级反响速率常数；二级反响速率常数； 底物底物A和底物和底物B的初始浓度；的初始浓度； ct时产物时产物C的浓度。的浓度。积分上式，得：积分上式，得：2k00,a b0020000()1ln()b ack taba bc3-33-4n连锁反响连锁反响n 酶催化酶催化A B C的反的反响响1122dak adtdbk ak bdtdck adt式中：式中： A，B，C的浓度；的浓度； 各步反响的速率常数；各

7、步反响的速率常数；12,k k, ,a b c3-53-62k1k3-7n假设假设A的初始浓度为的初始浓度为a0，n B和和C的初始浓度为的初始浓度为0，n 并且并且a+b+c=a0，那么可求得：，那么可求得：112120102102121()(1)(1)k tk tk tk tk taa ek abeekkackekekk3-83-93-10二、单底物酶促反响动力学二、单底物酶促反响动力学n单底物酶促反响指一种反响物底物参单底物酶促反响指一种反响物底物参与的不可逆反响。如：水解酶、异构酶和与的不可逆反响。如：水解酶、异构酶和多数裂解酶催化的反响。多数裂解酶催化的反响。n1、米氏方程、米氏方程

8、n Henri中间复合物学说中间复合物学说n Michaelis-Menten方程方程n Briggs-Haldane方程方程n动力学特征米氏方程的讨论动力学特征米氏方程的讨论n动力学参数的求取动力学参数的求取 Henri Henri中间复合物学说：中间复合物学说：n式中：式中：nefree游离酶；游离酶；nCS底物浓度；底物浓度；nCES 酶酶-底物复合物浓度；底物复合物浓度；nCP产物浓度；产物浓度；nK+1酶与底物构成复合物的反响速度常数；酶与底物构成复合物的反响速度常数；nK-1复合物解离为酶和底物的反响速度常数；复合物解离为酶和底物的反响速度常数；nK+2ES复合物分解生成产物的反响

9、速度常数。复合物分解生成产物的反响速度常数。PEkk+1-1ES+2kESn反响速率：单位时间、单位反响体系中某一组反响速率：单位时间、单位反响体系中某一组分的变化量来表示。对均相酶催化反响，单位分的变化量来表示。对均相酶催化反响，单位反响体系常用单位体积表示。反响速率为：反响体系常用单位体积表示。反响速率为：1,SSdCrVdt 1PPdCrVdt式中：rs 底物S的耗费速率，mol/(L.s); rP产物P的生成速率， mol/(L.s); V反响体系的体积，L； CS底物S的物质的量，mol； CP产物P的物质的量，mol； t时间，s；n根据质量作用定律，根据质量作用定律，P的生成速率

10、可表示为：的生成速率可表示为：( 3-11 )式中：式中：CES 中间复合物中间复合物ES的浓度，它的浓度，它为一难测定的未知量，因此不能用它为一难测定的未知量，因此不能用它来表示最终的速率方程。来表示最终的速率方程。2PESrk C对上述反响机理，推导动力学方对上述反响机理，推导动力学方程时的三点假设：程时的三点假设：n1在反响过程中，酶的浓度坚持恒定，即：在反响过程中，酶的浓度坚持恒定，即：CE0=CE+CES。n2与底物浓度与底物浓度CS相比，酶的浓度是很小的，相比，酶的浓度是很小的，因此可以忽略由于生成中间复合物因此可以忽略由于生成中间复合物ES而耗费而耗费的底物。的底物。n3产物的浓

11、度是很低的，因此产物的抑制产物的浓度是很低的，因此产物的抑制造用可以忽略，也不用思索造用可以忽略，也不用思索P+EES这个逆这个逆反响的存在。反响的存在。n据此假设所确定的方程仅适用于反响初始形状。据此假设所确定的方程仅适用于反响初始形状。Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程推导过程：方程推导过程：n“快速平衡学说快速平衡学说rapid equilirium:n 假设：酶与底物反响生成复合物假设：酶与底物反响生成复合物,和复合物和复合物又解离成酶和底物的反响之间快速建立平衡又解离成酶和底物的反响之间快速建立平衡,而复合物解离成产物和酶而复合物解离成产物和酶,即即

12、ESE+P是整个是整个反响的限速步骤，即由酶和底物反响生成中间反响的限速步骤，即由酶和底物反响生成中间复合物的可逆反响在初速度测定时间内曾经到复合物的可逆反响在初速度测定时间内曾经到达平衡。达平衡。n根据上述假设和式根据上述假设和式3-11，有，有:2ESSPPCkdtdCdtdCr和和11ESSECkCCk或表示为：或表示为：SESSSESECCKCCkkC11式中：式中：CE游离酶的浓度，游离酶的浓度，mol/L； CS底物的浓度，底物的浓度，mol/L; KS解离常数，解离常数， mol/L;n反响体系中酶的总浓度反响体系中酶的总浓度CE0为：为：0ESEECCC)1 (0SSESESS

13、ESSECKCCCCKC所以：所以：即：即：SSSEESKCCCC0SSSPSSSEPCKCrCKCCkrmax,20( 3-12 )式中：式中： r P,max产物的最大生成速率，产物的最大生成速率，mol/(L . s); CE0酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L;n式式3-12即米氏方程，式中的两个动即米氏方程，式中的两个动力学参数是力学参数是KS和和rP,max。其中：。其中：11ESESSCCCkkKKS表示了酶与底物相互作用的特性。表示了酶与底物相互作用的特性。KS的单位和的单位和CS的单位一的单位一样，当样，当rP=1/2 rP,max 时，存

14、在时，存在KS=CS关系。关系。rP,max =k+2CE0。表示当全部酶都呈复合物形状时的反响。表示当全部酶都呈复合物形状时的反响速率。速率。k+2又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反响的分子数，因次，它表示酶催化反响才干的大小，物发生反响的分子数，因次，它表示酶催化反响才干的大小，不同的酶反响其值不同。不同的酶反响其值不同。rP,max正比于酶的初始浓度正比于酶的初始浓度CE0。实践运用中将。实践运用中将k+2和和CE0合合并运用为一个参数。并运用为一个参数。 Briggs-Haldane Briggs-Haldane

15、方程方程n19251925年，年，BriggsBriggs和和HaldaneHaldane对米氏方程的推导作了对米氏方程的推导作了一项很重要的修正。他们以为，当一项很重要的修正。他们以为，当k+2k+2k-1k-1时米氏时米氏假设中的快速平衡假设中的快速平衡ripid equilibriumripid equilibrium不一定可不一定可以成立，所以，不能用上述以成立，所以，不能用上述“平衡学说推导。即平衡学说推导。即当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适

16、用。他们提出了他们提出了“拟稳态假设，以为由于反响体系中拟稳态假设，以为由于反响体系中底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时所产生的酶又立刻与底物相结合，从而使反响体系所产生的酶又立刻与底物相结合，从而使反响体系中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随时间而变化。时间而变化。n根据反响机理和上述假设，有下述方程式：根据反响机理和上述假设，有下述方程式：2ESPCkdtdC11ESSESCkCCkdtdC0211ESESSEESCkCkCCkdtdC又由于有：又由于有：0ESEECCC所以：所以：S

17、SEESCkkkCCC1210n式中：式中：Km米氏常数，米氏常数，mol/L;nKm与与Ks的关系为：的关系为：SmSPSSEPCKCrCkkkCCkrmax,12120( 3-13)12121kkKkkkKSm( 3-14 )当当k+2k-1时，时，Km=Ks，即生成产物的速率，即生成产物的速率大大慢于酶底物复合物解离的速率。大大慢于酶底物复合物解离的速率。Km值的大小与酶、反响物系的特性以及反响值的大小与酶、反响物系的特性以及反响条件有关。条件有关。某些酶促反响的某些酶促反响的Km值：值：P30表表3-1M-M方程与方程与B-H方程比较见下表方程比较见下表n在在M-M方程和方程和B-H方

18、程的推导中都假设方程的推导中都假设CE0CS0，因此因此CES值也很小。假设酶的浓度很高，值也很小。假设酶的浓度很高， CES值值在反响过程中有能够是很高的。假设依然采用上述方在反响过程中有能够是很高的。假设依然采用上述方程会带来较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示程会带来较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：为：0ESEECCCPESSSCCCC011)(00ESPESSESESCkCCCCCkdtdC211)()(00ESPESSESEESCkkCCCCCkdtdC2ESPCkdtdC动力学特征米氏方程的讨论动力学特征米氏方程的讨论n根据米氏方程，根据米氏方程，酶反响的速度酶反响的速

19、度与底物浓度的与底物浓度的关系为一双曲关系为一双曲线，线，P30P30图图3-13-1。该曲线表示了该曲线表示了三个不同动力三个不同动力学特点的区域。学特点的区域。n当当CSKm时，该曲线近似为一程度线，表示时，该曲线近似为一程度线，表示当底物浓度继续添加时，反响速率变化不大。当底物浓度继续添加时，反响速率变化不大。此时酶反响可视为零级反响，反响速率将不随此时酶反响可视为零级反响，反响速率将不随底物浓度的变化而变化。这是由于当底物浓度的变化而变化。这是由于当Km值很值很小时，绝大多数酶呈复合物形状，反响体系内小时，绝大多数酶呈复合物形状，反响体系内游离的酶很少，因此即使提高底物的浓度，也游离的

20、酶很少，因此即使提高底物的浓度，也不能提高其反响速率。不能提高其反响速率。maxrrS( 3-16)SSCCtr0maxtrCCSSmax0即：即：或：或：n当当CS与与Km的数量关系处于上述两者之间的范的数量关系处于上述两者之间的范围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在t=0时，时，CS=CS0，对，对2-13式积分得到：式积分得到：SSmSSCCKCCtr00ln)(maxSmSSXKXCtr11ln0max或：或：式中：式中：00SSSSCCCX，XS为底物转化率。Levenspiel提出亦可用幂函数方式表示米氏方程，为：提出亦可用幂函数方式表示米氏

21、方程，为：SmmCKKSSCrrmaxn总结：总结：nM-M方程平衡假设：方程平衡假设：游离态酶浓度复合态酶浓度sSSESEESESSESEESSEKCCkkCCCCkCCCkCkCCk11111100B-H方程拟稳态假设：方程拟稳态假设：游离态酶浓度复合态酶浓度mSSESEESESSESEESESSESEKCCkkkCCCkkCCCCkCKCkCCCk211211211000)()(0)(动力学参数的求取动力学参数的求取n将米氏方程线性化，用作图法求取动力将米氏方程线性化，用作图法求取动力学参数学参数rmax或或k+2和和Km值。值。nA、Lineweaker-Burk法法L-B法法nB、H

22、anes-Woolf法法H-W法法nC、Eadie-Hofstee法法E-H法法nD、积分法、积分法A A、Lineweaker-BurkLineweaker-Burk法法L-BL-B法法n将米氏方程取倒数，得到：将米氏方程取倒数，得到：SmSCrKrr111maxmax以以1/rs对对1/CS作图得不断线，斜率为作图得不断线，斜率为Km/rmax，直线与纵轴交于直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于，与横轴交于-1/Km。此法称双倒数图解法。见图此法称双倒数图解法。见图2-2a。 B B、Hanes-WoolfHanes-Woolf法法H-WH-W法法n上式两边均乘以上式两边均乘以CS，得到

23、：，得到：maxSmaxmSSrCrKrC以以CS/rS对对CS作图，得不断线，斜率为作图，得不断线，斜率为1/rmax，直，直线与纵轴交点为线与纵轴交点为Km/rmax，与横轴交点为，与横轴交点为-Km。见图见图2-2b。C C、Eadie-HofsteeEadie-Hofstee法法E-HE-H法法n将米氏方程重排为：将米氏方程重排为：SSmSCrKrrmax以以rS对对rS/CS作图，得不断线，斜率为作图，得不断线，斜率为-Km，与纵轴交点为与纵轴交点为rmax，与横轴交点为，与横轴交点为rmax/Km。见图。见图2-2cD、积分法、积分法n将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入将动

24、力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入米氏方程的积分方式，经整理得到：米氏方程的积分方式，经整理得到：mSSmSSSSKCCtKrCCCC1ln000maxSSSSCCCC00ln与与SSCCt0对应作图，得到图对应作图，得到图2-2d运用直线作图法求取动力学参数：运用直线作图法求取动力学参数：n练习：练习：nP31例例3-3葡萄糖在葡萄糖异构酶存在葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时转化为果糖的反响是可逆反响，在平时转化为果糖的反响是可逆反响，在平衡形状下，底物和产物都有相当的量，衡形状下，底物和产物都有相当的量，必需思索逆反响。必需思索逆反响。n请参见解题和请参见解题和P11，三、可逆反响，双底物反

25、响和辅因子活三、可逆反响，双底物反响和辅因子活化动力学。化动力学。2、操作参数对酶促反响的影响、操作参数对酶促反响的影响在诸多影响酶催化活性的要素中，比较重要在诸多影响酶催化活性的要素中，比较重要的有的有pH值、温度、流膂力、化学试剂和辐值、温度、流膂力、化学试剂和辐射声、光等。其中最常遇到，影响最射声、光等。其中最常遇到，影响最大的是大的是pH值和温度的作用。值和温度的作用。pH值的影响值的影响温度的影响温度的影响pH值的影响值的影响 构成酶蛋白的氨基酸含构成酶蛋白的氨基酸含有碱性、中性和酸性基团。有碱性、中性和酸性基团。在一定的在一定的pHpH值下，酶具有值下，酶具有带正电荷基团也带有负电

26、荷带正电荷基团也带有负电荷基团，而这些基团常是构成基团，而这些基团常是构成活性点的部分。一种酶往往活性点的部分。一种酶往往只是在一种特定的电荷形状只是在一种特定的电荷形状下才具有催化活性。随着下才具有催化活性。随着pHpH值的变化，具有这种特值的变化，具有这种特定电荷形状的酶只占有总酶定电荷形状的酶只占有总酶的或多或少的一部分，酶的的或多或少的一部分，酶的相对活力有一个最大值，即相对活力有一个最大值，即相对活力相对活力-pH-pH曲线常呈钟罩曲线常呈钟罩形，见图。形，见图。n根据以上分析，根据以上分析，Michaelis对对pH值与酶活力的关值与酶活力的关系提出三形状模型的假设，根本点如下：系

27、提出三形状模型的假设，根本点如下：n1、假定酶分子有两个可解离的基团，随着、假定酶分子有两个可解离的基团，随着pH值值的变化，分别呈现出的变化，分别呈现出EH2、EH-及及E2-三种形状，三种形状，即：即：EH2 EH- E2-H+H+-H+H+n酸性条件下，酶呈酸性条件下，酶呈EH2形状；当形状；当pH添加，酶以添加，酶以EH-形状存在；当形状存在；当pH继续添加，酶以继续添加，酶以E2-形状存在。形状存在。n2、上述三种解离形状中，只需、上述三种解离形状中，只需EH-型具有催化活性。型具有催化活性。n3、底物、底物S的解离形状不变。的解离形状不变。n4、速率控制步骤为由、速率控制步骤为由E

28、HS-生成产物生成产物P的速率。的速率。n反响机理式可表示为：反响机理式可表示为：k-1k+2EH22S+EH-E2-EHS -ES 2-EH Sk+1KaKbKKabEH +P-根据酶催化反响动力学的普通原理，可有下述的根本关系式：根据酶催化反响动力学的普通原理，可有下述的根本关系式：0dtdCEHS( 3-29 )22220ESEHSSEHEEHEHECCCCCCC( 3-30 )2SPEHSrrk C( 3-31 )n假设定义：假设定义：n经整理可得到下式：经整理可得到下式：n式中：式中：Ka、Ka,、Kb、Kb,电离平衡常数，氢离子浓电离平衡常数，氢离子浓度。度。n CH+氢离子浓度。

29、氢离子浓度。,2EHHEHaCCCKEHHEbCCCK2,2SEHHEHSaCCCK2EHSHESbCCCK( 3-3235 )02212ESPEHSmSk C Crk Cf Kf CSmSSmSCKCrCffKCfrmax212max( 3-36 ),11HbaHCKKCf21bHaHCKfKC n由上式可以看由上式可以看出，出，f1 f1和和f2f2均均与与pHpH值有关。值有关。P21P21图图2-32-3表示表示了了pHpH值的变化值的变化对反响速率相对反响速率相对值的影响。对值的影响。从该图可以看从该图可以看出，对酶催化出，对酶催化反响适宜的反响适宜的pHpH值约处于值约处于6 69

30、 9之间。之间。图图3-3温度的影响温度的影响n温度对酶催化反响的影响是，在较低的温度范温度对酶催化反响的影响是，在较低的温度范围内，反响速率随着温度的升高而加快，超越围内，反响速率随着温度的升高而加快，超越某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，酶的反响速率反而随着温度的上升而下降。这酶的反响速率反而随着温度的上升而下降。这是由于温度升高，虽然可加速酶的催化反响速是由于温度升高，虽然可加速酶的催化反响速率，同时也加快了酶的失活速率。率，同时也加快了酶的失活速率。n在适宜的温度内，酶催化反响速率常数中的在适宜的温度内，酶催化反响速率常数中的k+2与温度的

31、关系符合与温度的关系符合Arrhenius方程。方程。 n即：即：n式中：式中：nA指前因子；指前因子；nEa反响活化能；反响活化能；nR气体常数；气体常数；n T绝对温度；绝对温度；)exp(2RTEAka( 3-37)假设以假设以lgk+2lgk+2对对1/T1/T对对应作图，可得不断应作图，可得不断线，由该直线的斜线，由该直线的斜率可求得活化能率可求得活化能EaEa值，该直线是以肌值，该直线是以肌球蛋白酶催化的球蛋白酶催化的ATPATP水解反响的数据做水解反响的数据做出的。出的。图图2-4n酶反响的酶反响的EaEa值，通常是正值，如能服从值，通常是正值，如能服从式式3-373-37，当温

32、度升高时，反响速率，当温度升高时，反响速率应会不断地增大，但实践上并非如此，应会不断地增大，但实践上并非如此，该式只局限于比较狭小的较低温度范围该式只局限于比较狭小的较低温度范围内才成立。在较高的温度范围内，酶因内才成立。在较高的温度范围内，酶因热失活，具有活性的酶量减少，因此使热失活，具有活性的酶量减少，因此使反响速率下降。因此出现一最正确的温反响速率下降。因此出现一最正确的温度范围。度范围。P35P35图图3-43-4中曲线中曲线a a表示的是过氧表示的是过氧化氢酶催化化氢酶催化H2O2H2O2分解时反响速率与温度分解时反响速率与温度的关系，该反响的反响速率也就是氧的的关系，该反响的反响速

33、率也就是氧的产生速率。产生速率。3 3、抑制剂对酶促反响速率的影响、抑制剂对酶促反响速率的影响n酶反响速率降低的缘由：酶反响速率降低的缘由：n失活失活指物理或化学要素部分或全部破坏了指物理或化学要素部分或全部破坏了酶的三维构造，引起酶的变性，导致酶部分或酶的三维构造，引起酶的变性，导致酶部分或全部丧失活性。全部丧失活性。n抑制抑制指在酶不变性条件下，由于活性中心指在酶不变性条件下，由于活性中心化学性质的改动而引起的酶活性的降低或丧失。化学性质的改动而引起的酶活性的降低或丧失。n抑制剂抑制剂导致抑制造用产生的物质称为酶抑导致抑制造用产生的物质称为酶抑制剂。制剂。抑制造用：抑制造用：可逆抑制：可逆

34、抑制：不可逆抑制：不可逆抑制：竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制混合型抑制混合型抑制竞争性抑制动力学竞争性抑制动力学n假设在反响体系中存在有与底假设在反响体系中存在有与底物构造相类似的物质，该物质物构造相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位也能在酶的活性部位 上结合，上结合，从而妨碍了酶与底物的结合，从而妨碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反响速率下降。使酶催化底物的反响速率下降。这种抑制称为竞争性抑制。该这种抑制称为竞争性抑制。该物质称为竞争性抑制剂。物质称为竞争性抑制剂。n主要特点：主要特点：n抑制剂与底物竞争酶的活性部抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制

35、剂与酶的活性部位位，当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物不能再与酶结合，结合后，底物不能再与酶结合，反之亦然。反之亦然。ESIn如：n竞争性抑制的机理为：n式中：I-抑制剂n EI-非活性复合物延胡索酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶SE PE IE EIES+2kkk-1+1kk+3-3丙二酸丙二酸n反响中底物的反响速率方程为反响中底物的反响速率方程为n根据稳态假设，可列出下述方程：根据稳态假设，可列出下述方程：n式中：式中：CI-抑制剂浓度抑制剂浓度n CEI-非活性复合物浓度非活性复合物浓度2ESSICkr0)(211ESSEESCkkCCkdtdC033EIIEEICkCCkdtdC0EIESEECC

36、CCn前面公式经整理可得下式：前面公式经整理可得下式：smISSIImsSICKCrCKCKCrrmaxmax1式中：式中：rSI有抑制时的反响速率，有抑制时的反响速率，mol/(L.s); KmI 有竞争性抑制时的米氏常数，有竞争性抑制时的米氏常数，mol/(L.s); KI抑制剂的解离常数，抑制剂的解离常数， mol/L;竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改动。竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改动。当当CI添加或添加或KI减小，都将使减小，都将使KmI值增大，使酶与底值增大，使酶与底物的结合才干下降，活性复合物减少，因此使底物反物的结合才干下降，活性复合物减少，因此使底物反响

37、速率下降。响速率下降。2-竟抑制竟抑制无抑制与竞争性抑制的反响速率无抑制与竞争性抑制的反响速率与底物浓度的关系曲线图：与底物浓度的关系曲线图：n对对2-竟抑制式取倒数，得到：竟抑制式取倒数，得到：SIImSICKCrKrr1111maxmaxSmISICrKrr111maxmax或：或：以以1/rSI对对1/CS作图，可得到不断线，该直线的斜作图，可得到不断线，该直线的斜率为率为KmI /rmax，与纵轴交点为，与纵轴交点为1/rmax，与横轴，与横轴交点为交点为-1/KmI。又：。又：IImmIImmICKKKKCKK1以以KmI对对CI作图，并根据此图求出作图，并根据此图求出Km和和KI值

38、。值。竞争性抑制动力学参数求取图：竞争性抑制动力学参数求取图：n抑制剂的解离常数抑制剂的解离常数KI可表示为：可表示为：n由此可看出，由此可看出，KI愈小，阐明抑制剂与酶愈小，阐明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶的催化反响才干的的结合力愈强，对酶的催化反响才干的抑制造用就越强。抑制造用就越强。n当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，合时，KmI与与CI的关系为不断线可称为的关系为不断线可称为线性竞争抑制；假设酶的活性部位与两线性竞争抑制；假设酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，那么个以上的抑制剂分子相结合，那么KmI与与CI的关系为一抛物线，可称为抛物线的

39、关系为一抛物线，可称为抛物线型的竞争抑制。型的竞争抑制。33kkKI非竞争性抑制动力学非竞争性抑制动力学n非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催化反响的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制化反响的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与酶的结合，这种景象称为非竞争性抑制。酶的结合，这种景象称为非竞争性抑制。ESISIEn在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合，在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合，也可与复合物也可与复合物ESES相结合，生成了底物相结合

40、，生成了底物- -酶酶- -抑制剂抑制剂的复合物的复合物SEISEI。绝大多数的情况是复合物。绝大多数的情况是复合物SEISEI为为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。还有一种是三元复合物还有一种是三元复合物SEISEI也能分解为产产物，也能分解为产产物，但对酶的催化反响速率依然产生了抑制造用。机但对酶的催化反响速率依然产生了抑制造用。机理式表示如下：理式表示如下：kk+1-1SE ES+2kPE IE kk+3-3EISEI kk+4-4SEIIES SEIkk

41、+5-5n从机理可知存在关系：从机理可知存在关系：0SEIEIESEECCCCC式中：式中：CESI底物底物-酶酶-抑制剂三元复合物浓度。抑制剂三元复合物浓度。0dtdCdtdCdtdCSEIERESsmsIsmIISESSICKCrCKKCCrCkrmax,max2)(1 ( 2-非竟抑制非竟抑制 )式中：式中：rR,max存在非竞争性抑制时的最大反响速率。存在非竞争性抑制时的最大反响速率。n对于非竞争性对于非竞争性抑制，由于抑抑制，由于抑制剂的作用使制剂的作用使最大反响速率最大反响速率降低了降低了 倍，倍，并且并且CICI添加、添加、KIKI减少都使其减少都使其抑制程度添加。抑制程度添加。

42、此时此时rSIrSI对对CSCS的的关系如图关系如图2-62-6所示。所示。IIKC1n根据根据L-B作图法，式作图法，式( 2-非竟抑制非竟抑制 )可整理为：可整理为：n或或SmIIIISICrKKCrKCr1111maxmaxSImISICrKrr111max,max,n以以 与与 作图，可得如下作图，可得如下图的直线关系。并求出图的直线关系。并求出Km和和r I,max值。值。SIr1SC1n又根据又根据n经过实验测得不同经过实验测得不同CI下的下的rI，max值，进而决议值，进而决议KI值。值。n假设三元复合物假设三元复合物SEI也能分解为产物，那么在机也能分解为产物，那么在机理式中添

43、加了一步理式中添加了一步 ，同样可整，同样可整理成方式上与理成方式上与( 2-非竟抑制非竟抑制 )类似的速率方程式，类似的速率方程式，所不同的仅是所不同的仅是rI,max所包含的参数上。所包含的参数上。n如何判别复合物如何判别复合物SEI能否分解为产物，可经过改能否分解为产物，可经过改动抑制剂用量，并测定底物的反响速率来判别。动抑制剂用量，并测定底物的反响速率来判别。IIIIICKrrrKCrmaxmaxmaxmax,1111PEISEIk6n非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是：非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是：n对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂对竞争性抑制，随着底物浓度的增

44、大，抑制剂的影响可减弱；的影响可减弱；n而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。弱抑制剂的影响。n由此可见，竞争性抑制造用是可逆的，非竞争由此可见，竞争性抑制造用是可逆的，非竞争性抑制造用是不可逆的。性抑制造用是不可逆的。根据实验数据判别竞争性抑制根据实验数据判别竞争性抑制和非竞争性抑制和非竞争性抑制反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学n反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物结合，而只能与复合物ES相结合生成相结合生成SEI复合复合物。物。SE kk+1-1ES+2kP

45、E IES kk+3-3SEI根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其速率方程为速率方程为)1 (maxIIsmsSIKCCKCrrSmISISICKCrrmax,IIIKCrr1maxmax,IImmIKCKK1或或3-反竟抑制反竟抑制n根据上述各定义式，可以推出：根据上述各定义式，可以推出：n以以rSI对对CS作图，得到以下图所示曲线。作图，得到以下图所示曲线。mmIIKrKrmaxmax,n根据根据L-B作图法，式作图法，式3-反竟抑制可改写为反竟抑制可改写为IISmSIKCrCrKr1111maxmaxn 以1/ rSI对1/CS作图。利用该

46、图求取动力学参数。线性混合型抑制动力学线性混合型抑制动力学n线性混合型的最简单机制可用下式表示：线性混合型的最简单机制可用下式表示：SE ES+2kPE IES SEIKsIE KISEI EISEI在上述机理中，在上述机理中，从左式来看，它根本上与非从左式来看，它根本上与非竞争性抑制的模型一样，所竞争性抑制的模型一样，所不同的是，当不同的是，当EI与与S相结相结合成合成SEI时，由于抑制剂时，由于抑制剂的存在影响了的存在影响了EI与与S的结的结合，因此其解离常数由合，因此其解离常数由Ks变变为为Ks，同样，同样ES与与I结合结合时，其解离常数由时，其解离常数由KI变为变为KI。IKKs11k

47、kKS33kkKIn根据上述机理式，可推出其速率方程为：根据上述机理式，可推出其速率方程为：n对此种抑制，对此种抑制，SmISISICKCrrmax,( 4-线混竟抑制线混竟抑制 )式中式中: Ks和和KI的修正系数，当的修正系数，当 =1，KI= KI时，上述抑制实为非竞争性抑制。时，上述抑制实为非竞争性抑制。IIIaKCrr1maxmax,IIIImmIKCKCKK11n前面曾经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争前面曾经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，但可用一普遍化的公式来表示。但可用一普

48、遍化的公式来表示。普遍化的机制可表示为右图。普遍化的机制可表示为右图。假设无假设无EIS存在，那么为竞存在，那么为竞争性抑制；假设争性抑制；假设E和和EI与与S有同等的结合力，且有同等的结合力，且EIS无无反响活性，那么为非竞争性抑反响活性，那么为非竞争性抑制；假设无制；假设无EI存在，且存在，且EIS无反响活性，那么为反无反响活性，那么为反竞争性抑制。竞争性抑制。n普遍化的公式可表示为：普遍化的公式可表示为：)1 ()1maxSIISISImSSIKCCKCKCrr（式中式中 KIS、KSI-分别为分别为EI与与S和和ES与与I相结合构成相结合构成SEI 的解离常数。的解离常数。 当当KIS

49、=KSI时，为非竞争性抑制；当时，为非竞争性抑制；当KSI时为竞争时为竞争性抑制，当性抑制，当KIS时为反竞争性抑制，当时为反竞争性抑制，当KISKSI且均为且均为常数值时，称为混合抑制。常数值时，称为混合抑制。n下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。 某些酶抑制剂的解离常数值某些酶抑制剂的解离常数值酶酶底物底物抑制剂抑制剂解离常数解离常数mmol/L醇脱氢酶醇脱氢酶-淀粉酶淀粉酶天冬氨酸酶天冬氨酸酶富马酸酶富马酸酶葡糖异构酶葡糖异构酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乙醇乙醇淀粉淀粉L-天冬氨酸天冬氨酸富马酸盐富马酸盐D-葡萄糖葡萄糖乳酸盐乳酸盐乙醛乙醛环已淀粉环已淀粉羟胺羟

50、胺丙二酸盐丙二酸盐木糖醇木糖醇丙酮酸盐丙酮酸盐0.670.230.040.04.50.18底物抑制底物抑制substrate inhibition实实践上有些酶的催化反响，由于底物浓度过践上有些酶的催化反响，由于底物浓度过高，其反响速率反而会下降，此种效应称高，其反响速率反而会下降，此种效应称为底物的抑制造用。为底物的抑制造用。底物的抑制动力学底物的抑制动力学n有些酶催化反响，在底物浓度添加时，有些酶催化反响，在底物浓度添加时，反响速率反而会下降，这种由底物浓度反响速率反而会下降，这种由底物浓度增大而引起反响速率下降的作用称为底增大而引起反响速率下降的作用称为底物抑制造用。此时的反响机理式为：

51、物抑制造用。此时的反响机理式为：SE kk+1-1ES+2kPE ESS kk+3-3SES式中式中 SES-不具有催化反响活性，不能分解为产物不具有催化反响活性，不能分解为产物的三元复合物。的三元复合物。n运用稳态处置，可得究竟物抑制的酶催化反响动力学运用稳态处置，可得究竟物抑制的酶催化反响动力学方程为：方程为：( 3-40 )或或SISSmSSKCCKrr1max式中式中 rSS-底物抑制的反响速率，底物抑制的反响速率， mol/(Ls)； KSI-底物抑制的解离常数，底物抑制的解离常数， mol/L；( 3-39 )max11SSinmSiSSIrrKCCKn底物抑制造用是在高底物浓度下

52、，随着底物抑制造用是在高底物浓度下，随着底物浓度的添加，反响速率经过一个最底物浓度的添加，反响速率经过一个最大值，当底物浓度大值，当底物浓度CS大于大于Csmax时，底时，底物浓度的添加反而引起反响速率的减小。物浓度的添加反而引起反响速率的减小。这种动力学行为对生化反响器的性能有这种动力学行为对生化反响器的性能有重要意义。重要意义。n底物抑制下的底物浓度和反响速率的定底物抑制下的底物浓度和反响速率的定量关系类似米氏方程的推导方法得出。量关系类似米氏方程的推导方法得出。在最简单的情况下，酶在最简单的情况下，酶-底物中间物底物中间物ES可以与第二个底物分子可以与第二个底物分子S结合生成第二个结合生

53、成第二个中间物中间物SES，且它不能进一步反响。，且它不能进一步反响。n当底物抑制时，当底物抑制时， rSS与与CS的关系表示在图的关系表示在图2-10戚中。戚中。根据图根据图2-10，速率曲线有一最，速率曲线有一最大值，即大值，即rS,max为最大底物耗为最大底物耗费速率。相对应的底物浓度值费速率。相对应的底物浓度值CS,OPT可经过下式求出：可经过下式求出：0,max,optSCSSdCdrSImoptSKKC,式中式中 CS,OPT-为最正确底物为最正确底物浓度浓度产物的抑制动力学产物的抑制动力学n产物抑制系指当产物与酶构成复合物产物抑制系指当产物与酶构成复合物EP后，就停顿继续进后，就

54、停顿继续进展反响的情况，特别是当产物浓度较高时有能够出现这种抑展反响的情况，特别是当产物浓度较高时有能够出现这种抑制。其反响机理如下：制。其反响机理如下：SE kk+1-1ES+2kPE PE kk+3-3EP所生成所生成EP为无活性的端点复合物。为无活性的端点复合物。n运用稳态法推导得出如下反响速率方程式：运用稳态法推导得出如下反响速率方程式：SPPmSSCKCKCrr1max( 3-45 )n式中式中 称为产物抑制解离常数。称为产物抑制解离常数。,33kkKP 与无抑制相比较，最大反响速率rmax值不变，米氏常数增大了 倍，同竞争抑制一样，使反响速率下降。PPKC1各种抑制的比较各种抑制的

55、比较n这里重要对竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等三这里重要对竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等三种有代表性的抑制动力学特点进展比较。种有代表性的抑制动力学特点进展比较。P37表表3-2列出了列出了上述三种抑制时的动力学参数的表示。上述三种抑制时的动力学参数的表示。抑制方式抑制方式最大速率最大速率米氏常数米氏常数竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制maxrIImKCK1/IIKCr1/maxIImKCK1mKIIKCr1/max 假设以L-B作图法进展比较，可参看图2-4、图2-7、图2-9。从图中可以看出，假设以无抑制CI=0的L-B直线为参数，当

56、为竞争性抑制时，其L-B直线与纵轴交点和无抑制的交点一样，而与横轴交点那么为-1/KmI；当为非竞争性抑制时，其L-B直线与横轴交点和无抑制的交点一样，而与纵轴交点那么为1/rI,max;当为反竞争性抑制时，其L-B直线与无抑制的L-B直线相平衡。三、复杂的酶催化反响动力学三、复杂的酶催化反响动力学n1、多底物酶反响动力学、多底物酶反响动力学n2、变构酶催化反响动力学、变构酶催化反响动力学1、多底物酶反响动力学、多底物酶反响动力学n转移酶、氧化复原酶和衔接酶类催化双底物或转移酶、氧化复原酶和衔接酶类催化双底物或多底物间的反响。多底物间的反响。n按反响方式和历程分为：按反响方式和历程分为：序列序

57、列(sequential)反响反响乒乓乒乓(ping pong)反响反响顺序反响顺序反响(ordered)随机反响随机反响(random)随机机制随机机制n游离酶上的结合部位对两个底物游离酶上的结合部位对两个底物S1和和S2都都是适用的，两个底物是适用的，两个底物S1和和S2能随机与酶结能随机与酶结合，其产物合，其产物P1和和P2也可随机地脱离酶。许也可随机地脱离酶。许多激酶的催化机制属于此种。多激酶的催化机制属于此种。n由乙酰辅酶由乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸的反响，和草酰乙酸生成柠檬酸的反响，以及氧化磷酸化过程中复原型辅酶以及氧化磷酸化过程中复原型辅酶NADH+H+与氧分子结合成水的酶催

58、与氧分子结合成水的酶催化反响等都是双底物反响的例子。对于这种化反响等都是双底物反响的例子。对于这种氧化复原反响系统，速率方程式推导和反响氧化复原反响系统，速率方程式推导和反响机理如下：机理如下：机理表示为：机理表示为：nE+S1 ES1nE+S2 ES2nES1+S2 ES1S2nES2+S1 ES1S2n k+1k-1k-2k+2kk+3-3kk+4-4PESESk521n反响速率可表示为：反响速率可表示为：n当假定当假定CS2CS2恒定时，经推导可得：恒定时，经推导可得：521SESSCkr12121max,SmSSSSCKCrr( 1- 随机随机 ),1223maxmax,SSCKrr2

59、2232411SSmSCKCKKK212122333222,SESSESESSECCCkkKCCCkkKn当假定当假定CS1恒定时，同样可推导得：恒定时，同样可推导得：21212max,SmSSSSCKCrr,1114maxmax,SSCKrr11141311SSmSCKCKKK11111ESSECCCkkK2121444SESESSCCCkkKn假设假设CS1和和CS2均在变化，那么可得一均在变化，那么可得一普遍的关系式：普遍的关系式：)(11212112121max134maxSSSSSSSSCKCKCCrCKCKCKrr( 1-随机随机-普遍普遍)式中：式中：CS1和和CS2分别为底物分

60、别为底物S1与与S2的浓度；的浓度；K1、K2、K3、K4分别为相应各步的解离常数；分别为相应各步的解离常数；k5为反响速率常数，根据总酶浓度不变的原那么，为反响速率常数，根据总酶浓度不变的原那么，假定假定K1=K4，K2=K3；n在有些双底物反响中，其中一种底物能够处于在有些双底物反响中，其中一种底物能够处于过量的形状，如水做为底物的情况。这时过量的形状，如水做为底物的情况。这时CS2CS2远远大于大于K2K2，式，式( 1- ( 1- 随机随机 ) )恢复到米氏方程的方式。恢复到米氏方程的方式。假设有辅因子参与反响，可以把辅因子看作第假设有辅因子参与反响，可以把辅因子看作第二种底物见下页图