贴壁细胞培养

1、贴壁细胞培养一、 克隆形成抑制试验原理 ：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一， 其基本原理是单 个细胞在体外持续增殖 6 代以上，其后代所组成的细胞群体， 成为克隆（集落）， 这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成 实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析， 了解细胞的增殖力和对生存环 境的适应性。 这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、 肿瘤放射生物学实验等。 常 见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞， 包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。材料与方法（一）用品：含 15%新生牛血清的 RPMI- 1 640培养液

2、、含 10%新生牛血清的 RPMI-1640、 培养液PBS 0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP 管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100卩g/ mL溶液，使用前稀释至所需 浓度。（二）操作： .制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌 SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打 成单个细胞，含10%!清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密 度为3X 102个/mL,接种于12孔板，1000卩L/孔。PBS过一遍，力卩1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸

3、出 0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取1001到 EP管混合，取101细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。重复。直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。 .待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000卩L,设6组0, 0.33，0.66,1.33 ，2.66，3.99 4.66 卩g/ml药物组，每组2复孔，转染后置37C, 5%CO,饱和湿度条件培养箱内孵育 7 天。计数：满体积 2000ul

4、 其中 药物浓度 100ug/ml 100ul NS: 0 100 N=20.33 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =6.6ul + NS 93.4ul N=20.66 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =13.2ul + NS 86.8 ul N=21.33 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * X X =26.6ul + NS 73.4ul N=22.66 卩 g/ml *2000ul =100ug/ml * XX =53.2ul+NS 46.8ulN=23.99卩 g/ml *2000ul =100ug/ml *

5、XX =79.8 ul+NS 20.2ulN=14.66卩 g/ml *2000ul=100ug/ml * XX =93.2 ul+ NS6.8 ulN=1eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix在EP管中。等待加药。N=2.吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥:刘氏染色法加 Liu A Solution 0.5 ml 染色 30 s。滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合，染色1 min。水洗, 干燥、拍照二、细胞传代原理 :培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细 胞密度过大， 致营养不足而引起细胞衰老、

6、停止生长甚至死亡。 为了维持细胞的 存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养 瓶内继续扩大培养。材料与方法（一）用品:含10%生牛血清的RPMI-1640培养液PBS 0.25%胰酶、EP管，细胞培养瓶。（二）操作: 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌 SW620细胞，PBS过一遍，力卩1ml0.25% 胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出 0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取1001到 EP管混合，取101细胞计数用。 细胞传代： 在之前制备的细胞悬液 2.5ml 中，用滴管吸取 1/3

7、滴管至细胞培养 瓶，后用滴管吸取3滴管含10%生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶 盖用酒精棉球搽拭后，放入37C 5%CO培养箱中孵育。三、MTTt匕色法原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂是一种 能接受氢原子的染料。化学名 3- （4，5-二甲基噻唑 -2 ）-2,5- 二苯基四氮唑溴 盐。商品名噻唑蓝，MTT活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。而死细胞无此功能。二甲基亚砜 DMSOh溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MT

8、T结晶物形成的量与细胞数成正比。与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。 材料与方法（一）用品：1 MTT液：称取250mgMTT放入小烧杯内，加 50ml PBS （0.01M，pH7.4 ）在电 磁力搅拌仪上搅拌30min。用0.22 um的微孔滤器除菌，分装 4度保存，2 周内有效。2. 10%新生牛血清的RPMI-1640, 0.25%胰酶，DMS（分析纯）3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100卩g/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。（二）步骤1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消

9、化细胞，1min,弃胰酶。2. 用10%、牛血清的1640培养液配成单个细胞，取1001到EP管中，吹打， 计数。3. 配 5000 个细胞/120ul。用 96 孔板，设 0, 2，4，8， 16，24 卩 g/ml组每空加入120卩l细胞。培养。4. 第二天，加入药物40卩l。5. 培养48h。每孔加入MTT（5mg/ml） 20卩l，继续培养4h。小心吸弃孔内的上清液。6. 每孔加入150卩l的DMSO震荡10min, 570nm测吸光值。满体积160ul 其中药物40卩l药物浓度100ug/ml（对照组加40卩INS）2 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =3.

10、2 ul+ NS36.8 ul4 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =6.4ul+ NS33.6 ul8 卩 g/ml *160ul =100ug/ml * XX =12.8ul+ NS27.2 ul16 卩 g/ml *160ul= 100ug/ml * XX =25.6 ul+NS 14.4 ul24 卩 g/ml *160ul= 100ug/ml * XX =38.4 ul+ NS1.6 ul5-FU 3.2 * 4 + NS 36.8 * 4 mix在 EP管中。等待加药。CCK-8法步骤1. 接种细胞， 用 0.25%的胰酶消化细胞， 1min, 弃胰酶。2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100卩1到EP管中，吹