用于末端烯烃生产的酿酒酵母组合代谢工程优化

1、用于末端烯烃生产的酿酒酵母组合代谢工程优化汇报人：汇报人：XXXXXX学号：学号：2062015XXX2062015XXX班级：硕士班级：硕士X X班班 武汉青山区石油化工厂生产废气武汉青山区石油化工厂生产废气研究背景研究背景天大研发大规模生物乙烯工厂天大研发大规模生物乙烯工厂减少石油生产燃料，使用可再生的低碳方法生产燃料迫在眉睫减少石油生产燃料，使用可再生的低碳方法生产燃料迫在眉睫研究背景研究背景n 生产洗涤剂、润滑液生产洗涤剂、润滑液n 高内能高内能n 兼容的碳氢化合物燃兼容的碳氢化合物燃料添加剂料添加剂n 兼容现有发动机平台兼容现有发动机平台n 应用层面不断扩大应用层面不断扩大n 市场需

2、求巨大，现有市场需求巨大，现有生产方法污染大生产方法污染大经济和环境层面上，生物烯烃的代谢工程方法开发具有很高的需求经济和环境层面上，生物烯烃的代谢工程方法开发具有很高的需求试验思路试验思路利用酿酒酵母来构建一种一步利用酿酒酵母来构建一种一步脂肪酸脱羧途径脂肪酸脱羧途径来生产来生产末端烯烃，并利用组合工程策略来提高烯烃的产量末端烯烃，并利用组合工程策略来提高烯烃的产量A试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论I.I.筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶使用来自于使用来自于Jeotgalicoccus spJeotgalicoccus sp的细胞色素脂肪酸脱羧酶的细胞色素

3、脂肪酸脱羧酶oleToleTJEJE用作脂肪酸脱羧基转化为末端烯烃(Rude et al., 2011)从它的从它的密码子优化版本密码子优化版本oleTJE-COoleTJE-CO和它的六个同源基因和它的六个同源基因中进行筛选中进行筛选将这些基因将这些基因克隆进高拷贝质粒克隆进高拷贝质粒pESC-URApESC-URA，然后转化进入酿酒酵母然后转化进入酿酒酵母诱导蛋白表达由使用抗诱导蛋白表达由使用抗6 6多聚组氨酸标签抗体多聚组氨酸标签抗体(HRP)(HRP)的蛋白质印的蛋白质印记记方法确认方法确认细胞培养生长细胞培养生长4848小时后小时后定量分析比较烯烃的产量，定性分析烯烃定量分析比较烯烃

4、的产量，定性分析烯烃的种类评估上述不同酶的表现的种类评估上述不同酶的表现试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论I.I.筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶筛选在酵母中进行烯烃生物合成的酶使用酵母细胞组合使用酵母细胞组合oleToleTJEJE同源染色体进行烯烃的生产。同源染色体进行烯烃的生产。oleToleTJE-COJE-CO、oleToleTSMSM、oleToleTMCMC、oleToleTSPSP、oleToleTBSBS、oleToleTMPMP和和oleToleTCECE的过度表达产生了的过度表达产生了不同链长烯烃的分布不同链长烯烃的分布。从从C11C11到到C19C19，不同链长的烯烃

5、用不同的颜色表示。，不同链长的烯烃用不同的颜色表示。试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论II.II.增加游离脂肪酸的产量增加游离脂肪酸的产量 Why?ACC1:ACC1:乙酰辅酶乙酰辅酶a a羧化酶羧化酶将将ACC1ACC1进行过度表进行过度表达，并且阻断达，并且阻断FAA1FAA1和和FAA4FAA4这两个主要这两个主要的脂肪酰基辅酶的的脂肪酰基辅酶的合成途径。合成途径。试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论II.II.增加游离脂肪酸的产量增加游离脂肪酸的产量 How?在在强诱导型启动子强诱导型启动子PGAL1PGAL1和和PGAL10PGAL10的控制下对含的控制下对含ACC1ACC1的的o

6、leTJE-COoleTJE-CO进行过进行过度表达度表达菌株菌株BY11BY11（ACC1ACC1，oleTJE-COoleTJE-CO）剔除掉剔除掉FAA1FAA1和和FAA4FAA4后表后表达达oleTJE-COoleTJE-CO产生了三种不同的菌株产生了三种不同的菌株BY12(faa1, oleTJE-BY12(faa1, oleTJE-CO)CO)、BY13(faa4,oleTJE-CO)BY13(faa4,oleTJE-CO)和和BY14(faa1faa4,oleBY14(faa1faa4,oleTJE-CO)TJE-CO)C试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论III.III.辅因

7、子的工程改造辅因子的工程改造a.辅因子的添加：亚铁血红素和过氧化氢辅因子的添加：亚铁血红素和过氧化氢 添加添加亚铁血红素亚铁血红素：oleToleTJEJE是细胞色素是细胞色素P450P450酶，它包括亚铁血红素作为辅因子，酶，它包括亚铁血红素作为辅因子，而细胞色素而细胞色素P450P450酶的过度表达会引起亚铁血红素的损耗。酶的过度表达会引起亚铁血红素的损耗。 添加添加过氧化氢过氧化氢：OleTJEOleTJE在过氧化氢中十分活跃，因为，过氧化氢是它唯一在过氧化氢中十分活跃，因为，过氧化氢是它唯一的电子和氧气供体来源。的电子和氧气供体来源。添加亚铁血红素：添加亚铁血红素：+ +87%87%，

8、添加过氧化氢的：添加过氧化氢的：+79%+79%两者都添加：两者都添加：+ +262%262%最高产量：最高产量：1.4mg/L1.4mg/L试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论III.III.辅因子的工程改造辅因子的工程改造b.HEM3HEM3的过度表达，的过度表达，CTT1, CTA1CTT1, CTA1和和CCP1CCP1的剔的剔除除 a a中中辅因子工程的方法来通过消除对辅因子的需求，这样做的代价比较大辅因子工程的方法来通过消除对辅因子的需求，这样做的代价比较大 控制控制血红素合成血红素合成过程中的过程中的限速酶限速酶，使其过度表达来，使其过度表达来提高细胞血红素的产量提高细胞血红素的

9、产量 剔除掉剔除掉CTT1, CTA1CTT1, CTA1和和CCP1CCP1基因来产生基因来产生过氧化氢酶缺陷过氧化氢酶缺陷菌株菌株n 只有只有BY16BY16表现出相表现出相对于对于BY14BY14略微较高略微较高的烯烃效价的烯烃效价n 两种方法协同效应两种方法协同效应生成的生成的BY17BY17相对于相对于菌株菌株BY14BY14，产量提，产量提高了高了23%23%，试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论IV.IV.烯烃的基因表达调优烯烃的基因表达调优 通常情况下，通常情况下，富培养基富培养基可以增加细胞的生长而使最终细胞量增加，从而使可以增加细胞的生长而使最终细胞量增加，从而使得烯烃的产

10、量也有所提高。得烯烃的产量也有所提高。 使用含使用含KanMXKanMX抗性标记抗性标记的的pRSpRS质粒来替换营养缺陷型质粒来替换营养缺陷型pESC-URApESC-URA质粒质粒 使用使用pRS41KpRS41K (low copy) and (low copy) and pRS42KpRS42K (high copy) (high copy)作为作为克隆载体克隆载体 使用使用PGAL1PGAL1 (a strong inducible promoter), (a strong inducible promoter),PPGI1PPGI1 (a weak (a weak constitu

11、tive promoter) and constitutive promoter) and PTEF1PTEF1 (a strong constitutive promoter) (a strong constitutive promoter) 在所有的载体中来调控在所有的载体中来调控oleTJE-COoleTJE-CO的的转录转录。BY22BY22包含了包含了强组合型启动子强组合型启动子P PTEF1TEF1在在低拷贝型质粒低拷贝型质粒pRS41KpRS41K上，上，表现出了很表现出了很高高的烯烃产量，的烯烃产量，2.1mg/L2.1mg/L，比，比BY17BY17高高4.44.4倍，比倍，

12、比对照组菌株对照组菌株BYJECOBYJECO高高38.338.3倍倍在在弱启动子弱启动子PPGI1PPGI1调控下的包调控下的包含含oleToleTJE-coJE-co的菌株在的菌株在高高拷贝质拷贝质粒粒pRS42K (BY21)pRS42K (BY21)上的烯烃产上的烯烃产量比量比低低拷贝质粒拷贝质粒pRS41K(BY20)pRS41K(BY20)的烯烃产量的烯烃产量高高2.22.2倍倍i)i)在在低拷贝质粒上使用强启动低拷贝质粒上使用强启动子子可以为烯烃生产提供足够的可以为烯烃生产提供足够的酶水平酶水平 ii)ii)在高拷贝质粒上使用强启在高拷贝质粒上使用强启动子可能会在细胞中产生动子可

13、能会在细胞中产生“代代谢压力谢压力”，使所有的途径对宿，使所有的途径对宿主酵母细胞无益主酵母细胞无益试验方法及结果讨论试验方法及结果讨论V.V.生物反应器过程优化生物反应器过程优化 使用使用BY22BY22 (faa1faa4ctt1cta1ccp1, PTEF1-HEM3, PTEF1- (faa1faa4ctt1cta1ccp1, PTEF1-HEM3, PTEF1-oleTJE-CO(pRS41K)oleTJE-CO(pRS41K)这株烯烃产量最高的菌株在摇瓶中培养，来测试在生这株烯烃产量最高的菌株在摇瓶中培养，来测试在生物反应器中进行的分批补料培养物反应器中进行的分批补料培养条件条件

14、温度、温度、pHpH、溶解氧浓度这三个参数作为控制变量、溶解氧浓度这三个参数作为控制变量 选择温度选择温度3030，无无pHpH参数控制参数控制，溶解氧浓度溶解氧浓度60%60%作为整个操作的条件作为整个操作的条件 总结总结a.a. 将将oleTJEoleTJE它的同源酶产物进行表征，它的同源酶产物进行表征，筛筛选选出能将游离脂肪酸转换为烯烃的出能将游离脂肪酸转换为烯烃的酶酶。得到了得到了oleTJE-COoleTJE-CO（将（将Jeotgalicoccus Jeotgalicoccus sp.sp.进行进行oleToleT密码子优化得到）表现出了密码子优化得到）表现出了很宽广的生产烯烃种类范围和并有很高很宽广的生产烯烃种类范围和并有很高的烯烃产量的烯烃产量b.b. 通过通过FAA1FAA1和和FAA4FAA4的剔除的剔除增加增加了了游离脂肪游离脂肪酸酸的含量从而的含量从而显著提高了烯烃生产效价显著提高了烯烃生产效价c.c. HEM3HEM3的过表达协同的过表达协同CTT1, CTA1CTT1, CTA1和和CCP1CCP1的的去除进