酶催化技术在医药工业中的应用

1、 广 东 科 贸 职 业 学 院毕 业 论 文题 目: 酶催化技术在医药工业中的应用 姓 名: 孙文斌 系 别: 生物技术系 专 业: 生物技术及应用 班 级: 11应生1班 指导老师: 黄百祺 日 期: 2014.4.5_独 创 性 声 明 本人声明所呈交的毕业论文(设计)是本人在指导教师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文(设计)中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得广东科贸职业学院或其他教育机构的证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本论文(设计)所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。论文(设计)作者签

2、名： 签字日期： 年 月 日摘要摘要 酶作为一种高效生物催化剂，具有高度的特异立体选择性及区域选择性，并在常温、常压和pH值中性附近条件下具有十分高效的催化活力。利用酶的高效选择性催化作用可制造出种类繁多的目的产物，避免了化学法合成中的许多不足。目前，酶催化技术在医药方面的应用是当前最为关注的领域之一，这主要是因为医药产品一般附加值高，且大多是光学活性物质，作为十分优良的手性催化剂酶，特别是用于多种高效手性药物的合成及制备将十分有效，潜力巨大。 本文将从生物催化酶的氧化还原，环氧化物的酶促开环，脂酶催化的手性拆分，羟氰酶催化的羟氰化反应几个方面来对酶催化技术在医药行业中手性药物合成的应用进行论

3、述。关键词 酶工程 酶催化 医药工业 酶法合成手性药品技术03目录目 录1前 言52生物催化的氧化还原72.1醇的酶促脱氢反应73环氧化物的酶促开环93.1 环氧化物的对映归一性酶促水解94酯酶催化的手性拆分114.1脂肪酶在工业上的应用114.2 脂肪酶或酯酶的应用实例115羟氰酶催化的羟氰化反应135.1甲砜霉素和氯甲砜霉素的酶化学法合成136目前酶催化已用于商业化生产的工艺156.1 荷兰DSM公司酶法合成氨苄头孢工艺156.2 荷兰DSM与日本TOSOH公司酶法生产阿斯巴甜（Aspartame）工艺156.3 BASF公司酶法拆分生产手性胺工艺15结 论16参考文献18致谢20前言1前

4、 言生物催化就是利用生物催化体系催化的反应过程，它是迄今为止人们所知道的最高效和最具选择性的温和催化体系，也是典型的环境友好的催化体系。生物催化不仅可以得到纯度很高的产物，而且由于其高度的立体选择性可以获得很多常规方法难以合成的光学纯手性化合物。酶具有以下一些特点，使其成为有机合成中很有吸引力的一类催化剂，首先，酶是手性催化剂。它们是经过净化而具有专一性催化结构的特殊蛋白质。酶通常与底物非常特异性地结合在一起，从而表现出高度的区域选择性、立体选择性和对映选择性。这些重要的特征免除了传统有机合成中为了阻断不必要的副反应，通常需要基团保护和极端压力、重金属以及其他一些化学催化剂所必须的条件。多步串

5、联的生物催化反应也可以在一种微生物体内高效地进行。酶反应同在在20到70之间非常高效地进行，因此能量输入很少。随着基因组学、分子生物学和体外进化技术点的成熟，人们可获得专门用于某一合成目标的高效和可调的生物催化剂。正是因为酶催化剂具有高度的对映体选择性，使得手性合成成为生物催化最具吸引力的应用领域。这一发展趋势的驱动力之一来源于单一对映体药物巨大且仍不断增长的市场需求1。虽然单一对映体可以通过许多途径，如手性源技术、手性色谱、化学或生化拆分、化学催化不对称合成等方法获得，生物催化部队称反应正越来越成为化学家考虑的重要途径。如有Technology Catalysts 公司就于手性技术发展趋势所

6、作的一份调查就显示出了对生物催化的高度兴趣（CEN ,2003-05-05）。DSM公司的Wubbolts博士在“science”(2003,299:1694)上发表的文章中也预测了生物催化的稳健增长：“生物催化正蓄势待发，在对映体拆分和不对称合成等各种应用中将获得更加广泛的工业应用”。他特别提示，生物催化很有可能对一些有机化学尚未圆满解决的问题给出理想的答案。由FrostSullivan公司所作的另一份调查表明，在2002年全球手性产品的70亿美元的收入中，55%的贡献来自于传统的技术（手性源和分离），35%来自于化学催化，10%来自于生物催化。该调查报告预测，到2009年末，全球手性产品的

7、收入将达到149.4亿美元，其中传统技术的贡献率将下降41%，化学催化技术的份额则维持在36%左右，而生物催化技术的贡献率将进一步攀升至22%。由此可见生物催化技术在手性技术中扮演越来越重要的角色。21生物催化的氧化还原2生物催化的氧化还原氧化还原酶在活细胞的代谢和能量转化中起着非常重要的作用。据估计，所有的生物转化过程中设计的生物催化剂有25%为氧化还原酶。传统化学催化的氧化还原反应，往往需要重金属催化剂遗迹等当量的氧化/还原剂，反应条件剧烈，副反应多，难以控制，反应效率低，而且存在严重污染。与传统化学催化转化相比，生物催化的氧化还原反应具有反应条件温和、化学专一性高等显著优势，能直接利用廉

8、价易得的氧气、过氧化氢等作为氧化剂或利用糖类、短链脂肪醇类作为还原剂H的来源，催化反应不存在环境污染。更重要的是，通过生物催化的氧化还原反应，可以直接从非手性底物出发，以100%的收率获得近乎光学纯的手性产物，其产物可以作为很多重要手性药物的合成前体。下面以醇的酶促脱氢反应为例，对生物催化的氧化还原作叙述。2.1醇的酶促脱氢反应醇的酶促脱氢产生酮或醛属于生物氧化的一部分，催化反应需要氧化型辅酶（如NAD+或NADP+）的参与，催化的反应是可逆的，但是平衡偏向于醛、酮的还原。另外，脱氢酶催化的醇氧化反应通常在较高pH（89）下表现高的活力，但在此条件下辅因子以及产物（特别是醛）不稳定，因此与催化

9、还原相比，酶促脱氢的报道相对较少。脱氢酶能催化仲醇的对映选择性脱氢氧化，其中马肝醇脱氢醇（HLADH）是常用的一种酶。Matsuyama等2分离获得两株菌：Kluyveromyces lactis IFO 1267和Candida parapsilosis IFO 1396,两株菌分别催化（R）-型和（S）-型1，3-丁二醇的对映选择性脱氢，如图2-1所示。对氧化产物4-羟基-2-丁酮进行选择性酶促还原可以100%的理论产率获得单一构型的1,3-丁二醇。 图2-1 具有相反立体选择性的微生物催化1,3-丁二醇拆分生物催化的氧化还原Hummel等3获得了两株对仲醇具有高对映选择性的微生物：Lac

10、tobacillus kefir 的醇脱氢酶是（R）-构型专一性的，而Rhodococcus erythropolis是（S）-构型专一性的。两株菌的脱氢酶及剩余的醇；在第二步用相反立体选择性的醇脱氢酶催化酮不对称还原，最终可以100%的产率获得所需的光学纯对映体，见图2-2。图2-2 醇脱氢酶催化的仲醇去消旋化对于多羟基化合物，使用传统的化学氧化剂对其进行选择性氧化是很难实现的，通常需要对其余羟基进行一系列繁琐复杂的保护-去保护步骤。与此相反，酶催化氧化就没有这种缺点，生物体中存在许多酶可以催化糖或一些多羟基化合物选择性氧化为酮醇或酮酸。Matsumura等实用Candida boidini

11、i KK912整细胞催化1,2,4-丁三醇的仲羟基氧化产生相应的1,4-二羟基-2-丁酮，在反应混合物中检测不到其他的氧化产物4。环氧化物的酶促开环3环氧化物的酶促开环环氧化物是一种非常活泼的亲电化合物，可与多种含有亲核官能团的化合物反应。从光学纯的手性环氧化物出发，可以获得许多有用的复杂手性化合物，如图3-1。图3-1 手性环氧化物与不同亲核试剂的反应（*代表手性）3.1 环氧化物的对映归一性酶促水解环氧水解酶可以催化环氧化物的开环水解，通过消旋环氧化物的选择性酶促水解，可以同时获得高光学纯度的环氧化物和邻二醇，后者可以通过化学法环化为相应构型的环氧化物。另外，邻二醇的环硫酸酯或亚硫酸酯也是

12、一种高活性的反应中间体，可与多种亲核试剂反应，是有价值的手性化合物合成中间体。酶促环氧化物水解有两个进攻位点，当酶分别作用于一对对映异构体的不同位点，消旋底物完全水解时，可以得到光学纯杜很高的邻二醇产物，这在其他化合物的酶促拆分中是不可能的，这种现象被称为对映归一性酶促水解。许建和等5在绿豆（Phaseolus radiatus L.）中发现两种心的环氧水解酶，二者均能催化消旋苯乙烯环氧化物的对映归一性水解。两种酶都是分别作用于S-构型底物环氧乙烷环的-位以及R-构型底物环氧乙烷环的-位，因此趋同性地得到同一种手性二醇（R）-邻二醇，见图3-2。两种酶对于对硝基苯乙烯氧化物的位置选择性洗漱（S

13、或R）均在90%以上。这样用绿豆粉作为廉价的生物催化剂，通过一步转化即可从外消旋的环氧化物不对称合成获得（R）-二醇（表3-1）。其中以对硝基苯乙烯氧化物为底物，完全水解时产物二醇的ee值为82.4%，经一步结晶后光学纯度即可达到99%ee以上，总收率为68.7%。环氧化物的酶促开环图3-2 绿豆环氧水解酶组分A和组分B的位置与对映选择性表3-1以绿豆粗粉为催化剂在制备规模催化环氧化物的对映归一水解底物酶催化水解（完全转化）进一步重结晶后eep/%收率%eep/%总收率%2082.483.59968.72162.377.42260.788.474.569.2酶促催化的手性拆分4酯酶催化的手性拆

14、分酯酶或蛋白酶催化的手性底物酯可分为两种类型6：I型为手性羧酸与手性醇构成的酯；II型酯为手性醇与非手性羧酸构成的酯。无论是哪种类型的手性酯，都要求手性中心尽可能在反应位点的附近，酶才能显示其手性识别的能力。因此，一般的美在催化拆分-取代的手性酸或手性仲醇时，效果较好，而在拆分-取代的寿星算或手性伯醇时，则效果一般不太理想。为了提高酶反应的速率，一般要求酯的飞手性醇基或手性酰基部分尽可能小，并且最好带有吸电子基团。例如，I型酯的醇基部分常使用甲基、乙基、甲氧甲基、氰甲基、2-卤乙基等；而II型的酰基部分则常用乙酰基、丙酰基以及卤代乙酰基等。4.1脂肪酶在工业上的应用在结构复杂的手性药物及中间体

15、的合成中，酶法合成常常会表现的比其他的合成方法更具有优势，在Glaxo Welcome公司正开发的一种抗白血病的药物核糖嘌呤类化合物（506U78），使用脂肪酶CAL-B，活性酯为酰基化试剂，可选择性合成5-核糖乙酯，区域选择性高达99%，由于核糖由多个羟基，如此高的选择性是用一般常规的化学方法所不能达到的。随着脂肪酶在化学合成工业上的应用变得越来越简单，一些化学工业公司开始加强生物催化过程在合成中的应用研究与开发。其中Bayer公司在20世纪90年代中期开发了对映选择性水解消旋乙酰胺的工艺。反应采用南极假丝酵母Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)为催化剂，以高的对映体过

16、量值（99.5%ee）生产游离的(R)-胺7(图4-1)图4-1 Bayer公司开发的（R,S）-乙酰胺对映选择性水解过程酶促催化的手性拆分4.2 脂肪酶或酯酶的应用实例利用水解酶合成手性化合物的例子不胜枚举。例如，-取代季碳丝氨酸是一些具有重要生理活性物质的合成砌块，季碳手性中心的生成仍然是目前有机化学的难点之一。含季碳中心的1,3-丙二醇可以在脂肪酶PPL的催化下以大于80%的产率和95%的ee值实现去对称化（图4-2）。去对称化产物可以在简便的方法下转化成-取代季碳丝氨酸8。图4-2 通过1,3-丙二醇的酶促去对称化合成-取代季碳丝氨酸又如奥硝唑和噻克硝唑具有广谱的抗厌氧菌的活性，其中噻

17、克硝唑的光学易购未见报道。林国强等应用脂肪酶促的乙酰化反应拆分可以得到光学纯的（R）-奥硝唑、（S）-奥硝唑、（R）-噻克硝唑、（S）-噻克硝唑羟氰酶催化的羟氰化反应5羟氰酶催化的羟氰化反应光学纯氰纯是一类重要的合成中间体，它们的合成可通过化学催化不对称合成及羟氰酶催化的羟氰化反应来实现。羟氰酶（HNL）催化氢氰酸对羰基化合物（醛和酮）的不对称加成生成的光学活性氰纯，是100%原子经济性的反应，再加上酶催化方法本身的高效和环境友好，在工业方面相对化学催化的羟氰化更有优势。因此，许多公司近年来投入大量人力和资金进行羟氰酶的研究，如荷兰帝斯曼(DSM)、德国默克（Merck）、比利时塔萨勒（Tes

18、senderlo）和日本触媒株式会社等。5.1甲砜霉素和氯甲砜霉素的酶化学法合成巴达木羟氰酶在可调节的微水相粗酶反应体系中，以95%的产率和96%的ee值合成4-甲硫基扁桃氰醇，通过一次次重结晶氰醇的ee值可以提高到99%。通过一系列反应（图5-1）可合成中间体45。图5-1 甲砜霉素和氯甲砜霉素关键中间体合成从羟基化合物45出发，经过图5-2所示的路线分别得到甲砜霉素和氯甲砜霉素。从对甲硫基苯甲醛计算，经过9步反应，以29%的产率立体选择性地合成了甲砜霉素48；进过11步反应，以20%的产率立体选择性地合成了氯甲砜霉素。这也是首例通过酶-化学法立体选择性合成氯甲砜霉素529。羟氰酶催化的羟氰

19、化反应图5-2甲砜霉素和氯甲砜霉素的酶化学法合成目前酶催化已用于商业化生产的工艺6目前酶催化已用于商业化生产的工艺6.1 荷兰DSM公司酶法合成氨苄头孢工艺其工艺特点是采用D-苯甘氨酸酰胺或甲酯与7-氨基3-脱乙酰氧基头孢霉烷酸（7-ADCA）在固定化的青霉素酰化酶催化下，水相中，接近室温条件下合成氨苄头孢。去掉了化学合成工艺中需保护氨基成邓盐或酰氯的步骤，以及低温有机相反应条件。终产品中无有机残留，是一条无污染、低能耗、有竞争力的绿色酶催化新工艺。已运行的装置规模为100TA.6.2 荷兰DSM与日本TOSOH公司酶法生产阿斯巴甜（Aspartame）工艺荷兰DSM与日本TOSOH公司共同投

20、资在荷兰建成2500ta阿斯巴甜的酶法合成工艺装置，其工艺特点是采用混旋苯丙氨酸甲酯，用嗜热蛋白酶催化，在水溶液中进行选择性合成，未反应的苯丙氨酸甲酯分离后，经消旋后再用于合成，产品易分离，纯度好，反应条件温和污染小。由于采用混旋苯丙氨酸甲酯，成本低，步骤少，是非常具有竞争力的绿色工艺。6.3 BASF公司酶法拆分生产手性胺工艺光学活性的手性胺作为手性药物的中间体，手性合成砌块和手性试剂，在手性药物的生产和光学活性化合物的制备中有重要的应用，BASF公司采用脂肪酶拆分生产几十种不同的手性胺，目前年产已达1000t，二期工程将扩产至1500ta，其产品是通过以多品种的混旋手性胺为原料，经脂肪酶催

21、化，选择性酰化拆分来进行生产的。其工艺特点是可以不用溶剂，通过脂肪酶柱子进行反应，采用蒸馏分离，操作和分离简单，步骤少。结论结 论综上所述，酶催化已经成为有机手性合成和手性制药工业的重要手段。随着酶催化工程方面的发展以及可用酶的增加，将会有更多的工艺用于精细化学品和手性制药工业。酶催化仅仅是一个年轻的科学，发展的空间很大。正如France Arnold教授在21世纪化学的挑战研讨会上所说的那样“酶催化的未来只会被我们想象力所限制”。参考文献参考文献1 许建和,杨立荣,孙志浩，徐岩.迅速发展中的不对称生物催化技术.生物加工过程,2005,3:12 (a)Matsuyama A,Ymamoto H,Kawada N,Kobayashi Y.J Mol Catal B:Enzym,2001,11:513(b)Ymamoto H,Kawada N,Matsuyama A,Kobayashi Y.Biosci Biotech Biochem,1999,63:1051.3 Hummel W,Riebel B.Ann N Y Acad Sci,1996,799: