病毒遗传分析3课时参考PPT

1、1 第八章第八章 病毒的遗传分析病毒的遗传分析2一、病毒及其基因组 0.2课时二、phage增殖与突变型 0.4课时三、重组测验与作图 0.4课时四、互补测验与作图 1.4课时五、专一性转导重组 0.6课时目目 录录3一、病毒及其基因组一、病毒及其基因组(virus and its genome) 病毒(virus)体内无核糖体、翻译及能量转换系统，也没有完整的细胞结构。所以，称病毒为非原核(prokarytes)、非真核生物(eukarytes)的分子生物。但它为遗传物质证实、三联密码破译、基因概念发展、基因表达调控和基因工程发展作出巨大贡献。 动物、植物和微生物病毒中，将细菌、真菌及藻类中

2、的病毒往往称为噬菌体(phage)。（一）病毒及噬菌体病毒及噬菌体(virus and phage) p1841.结构简单、形态丰富 蛋白质外壳+dna或rna； 环、杆、卵、丝状多种形态2.体积小、繁殖快 1m；20min/代3.寄生，无翻译和能量转换系统 无独立代谢能力(二二)病毒的特点病毒的特点4（三）病毒的种类病毒的种类p185p185一、病毒及其基因组一、病毒及其基因组(virus and its genome)1、按遗传物质性质分类(遗传和基因工程学角度) dna类(单、双链，正、反义链)；rna 类(单、双链)2、按寄生关系分类(遗传、免疫和病毒学角度)烈性(virulent)噬

3、菌体；温和(temperate)噬菌体3、按形态分类(临床诊断和医学角度) 蝌蚪、环、线、卵、丝状等 如下噬菌体中t、tmv、在基因工程中应用最多51. 烈性噬菌体(virulent phage) p186p186二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型 因裂解寄主得名增殖:附着寄主dna侵入复制表达蛋白并剪寄主dna子代误装寄主裂解、转导噬菌体释放。特点：侵染：dna侵入蛋白质外留复制表达：生产头尾部蛋白、寄主dna片段误装裂解：寄主被裂解转导噬菌体释放(一) phage繁殖与侵染62. 温和噬菌体(temperate phage) 与寄主共存增殖：附着寄主 dna侵入整入寄主基因组内共

4、存称溶源或诱导裂解,再次裂解循环。 插入噬菌体后的细菌称溶源菌。特点：侵染:dna侵入，蛋白质外留溶源循环:插入寄主基因组内,共存表达裂解循环:复制表达诱导进入裂解循环二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型(一) phage繁殖与侵染73. 溶源菌特性 p188p188免疫性 整合到细菌染色体上的噬菌体称原噬菌体(prophage)，被侵染的细菌称溶源菌。噬菌体侵染的细菌不会再被同种噬菌体侵染的特性称免疫性。如入侵后，其阻遏蛋白抑制自身复制和近源菌侵染。 可诱导性 溶源菌自发或诱导产生0.01%的细菌被裂解，称溶源菌可诱导性。 噬菌体整入细菌基因组内称溶源，噬菌体侵入寄主被破坏称裂解。能

5、溶源和裂解的噬菌体为温和型，是基因工程载体。二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型(一) phage繁殖与侵染8（二）噬菌体突变类型二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型1.条件致死突变(phage condition lathal) 热温敏突变(temperature sensitive mutation ts) 30下存活，40-42致死。可进行基因定位。 x174 ts与wt30培养10h再42下培养10h，菌斑表型有什么不同？9 噬菌体氨基酸密码突变成终止密码，称无义突变。uac(酪) uag无义突变，称琥珀(amber) 突变，记为am；uac(酪) uaa无义突变，称赭

6、石(ocher) 突变，记为och；ugc(半) uga无义突变，称乳白(opal) 突变，记为op。2.无义突变(nonsense mutation) p190p190（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型 抑制无义突变表达的反密码子称无义突变抑制因子，有该因子的寄主为su+。如细菌trna反密码子atc突变成auc时，am突变噬菌体能生存。没有无义突变抑制因子的寄主，记为su-。二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型102.无义突变抑制因子(suppressor- nonsense mutation su+)证实（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型 无义突变抑制因子与无义突变之

7、间有严格的对应关系。如su+am寄主只能抑制am突变表达，su+op寄主只能抑制op无义突变表达，但su+och寄主能抑制amb和och无义突变表达(表1)。 如：琥珀型无义突变寄主因反密码子摇摆性能接上丝、酪、谷酰氨酸3种氨基酸，选得su+1、su+2和su+3等3种寄主，其蛋白质合成量分别为野生型14%-55%(表2)。 二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型11（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型3.形态突变二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型速溶性突变r- 溶解寄主快呈大斑，r+呈小斑广寄主突变h- 能浸染e.colib1和b2，h+仅侵染e.colib1，e.col

8、ib1+b2培养基上h-呈透明斑，h+呈半透明斑提问： h+r-基因型菌斑形态是什么？h-r-，h+r+基因型的菌斑形态怎样？ t4噬菌体r区突变后寄主范围变窄，由野生型e.colib、k菌株寄生变为e.colib寄生，问r47能否在e.colik株上生长。12（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型4.缺失突变二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型尾部缺失突变27 仅有头部和丝盘能生存，但无侵染力头部缺失突变23 仅有躯干和丝盘能生存，但无侵染力 突变体23与27混合后，因功能互补能形成有侵染力的个体132、计算rf值及作图 rf(r-b)=(12+12)/（42+12+12+34）=

9、24%，即24cm r h 24.0 r h+与r+h双亲直接感染e.coli b1和b2 结果如下基因型： r+h- r- h+ r- h- h+ r+表型型： 透明小 半透明大 透明大 半透明小菌斑数： 42 34 12 12 求rf(r-b)=重组子数/总数100%1、杂交重组法测定基因距离（一）（一） t2phage两点基因作图两点基因作图 p193p193三、重组测验与作图三、重组测验与作图14（二）（二） t4phage 3 点基因作图点基因作图p195p1952.计算重组值rf(m-r)=(520+474+162+172)/10342=12.8rf(tu-r)=(852+965+

10、162+172)/10342=20.8 rf(m-r) =(520+474+852+965)/10342=27.13.作图m 12.8 r 20.8 tu三、重组测验与作图三、重组测验与作图1.杂交重组法t4速溶r ,小斑m,浑浊tu三突变体与野生型杂交，结果如下15（三）（三）t4噬菌体重组测验噬菌体重组测验(recombination test) p191p191三、重组测验与作图三、重组测验与作图 benzer，收集了t4phage r区3000多个突变体。为测定这3000多个基因的距离发明了用双重感染测定法。该方法可以检查到2bp间的遗传距离,称基因精细结构的重组测验。 r47与r14

11、5突变体，先成对感染大肠杆菌b株，因各类基因型均能产生菌斑，为总配子数；他们的混合培养液再感染大肠杆菌k株， 只有野生型噬菌体才能侵染k株。即k株上的菌斑必定为重组配子。从而求得r47与r145突变基因的重组率。r145与r47成对首次感染b获得总菌斑数e.coli k株混合液二次感染k, 获得重组型菌斑数e.coli b株r145 + + r47重组率rf(r47-145)= 4/12100 =25%双重+ + r1 r2 + r2 r1 + 16（三）（三）t4噬菌体重组测验噬菌体重组测验(recombination test) 三、重组测验与作图三、重组测验与作图 benzer用双重感染

12、法测定3000多个突变体两两间的遗传距离。即测定了3000多个突变基因间的重组率，绘图如下。17 benzer将t4phage r区3000多个突变体两两成对，直接感染e.coli k株上(不允许基因交换)，测定突变基因遗传功能,称互补测验。（一）（一）t4噬菌体互补测验噬菌体互补测验(complementation test) p196p196四、互补测验与作图四、互补测验与作图e.coli k株r104 + + r47遗传功能不互补为同1个顺反子,为什么？e.coli k株r102 + + r47遗传功能互补为2个不同顺反子,为什么？因2基因位于1个a基因之内，不互补因2基因均位于1个b基

13、因之内，不互补因2基因位于a、b基因间，功能互补18（一）（一） t4phage互补测验互补测验2. 互补测验与基因功能研究p200p200四、互补测验与作图四、互补测验与作图23与27突变体遗传功能互补突变基因13必定与头部装配基因有关，为头部发育基因。突变体23：有基盘无头部突变体27：有头部无基盘 分别感染细菌均无菌斑，混合感染细菌有菌斑说明什么？突变体13是什么基因 突变体13与27混合感染有菌班，但与 23 混合无菌班，该突变体为何基因？19（一）（一） t4phage互补测验互补测验3.t4phage发育遗传图谱p199p199 用上述方法完成了65个突变体互补测验，将这60多个条

14、件致死突变基因联系起来揭示了t4phage的发育遗传图谱。 突变40-47为早期功能基因，即头部、躯干、dna、丝盘等基本物质控制基因。突变13等基因为头部、尾部、尾丝均有但不能装配，为装配成熟晚期功能基因。四、互补测验与作图四、互补测验与作图20（一）（一） t4phage互补测验互补测验4. t4phage发育基因的基因内互补p201p201 t4phage 65个突变体互补测验结果表明：同1亚类不同突变体之间能功能互补称基因内互补。可将其发育调控基因分成3类：头部装配基因：共16个基因内不互补基因，但20-24、31、40与 16、17、49之间有基因内功能互补。尾部装配基因：有3-11

15、、15、18、19、25-29、51、53共20个基因。尾丝装配基因：有35-38、57、63共6个基因。 将他们之间的遗传距离，绘制成t4phage发育图谱。四、互补测验与作图四、互补测验与作图21（二） x174互补测验1、x174 噬菌体 p198p198四、互补测验与作图四、互补测验与作图 x174 噬菌体发现39个mutant：32个无义、7个温敏突变，见下图。成对直接感染e.coli测定功能是否互补。 am8与am14成对感染e.coli有斑，互补，为两个不同的顺反子。 am8与am33成对感染e.coli无斑，不互补，同一个顺反子。 22（二）（二） x174互补测验互补测验2、

16、x174 的顺反子四、互补测验与作图四、互补测验与作图用上述两两成对混合接种的测验方法，测定了x174噬菌体39个突变体，发现它们分别属于8个遗传功能不同的基因，即8个不同的顺反子。如 am8, 18, 30, 33, 35, 50, 86, tsl28为同一个顺反子a ； am8与am14,am16,och11,och5为两个不同的顺反子ab 。23(三三) x174 x174互补测验与互补测验与作图作图 补补1、利用am标记性状选择，获得a-b基因重组率四、互补测验与作图四、互补测验与作图 即，两菌种混合分别接种到su+和su-上，分别获得总配子数和ab基因间重组配子数，求得重组率。亲本基

17、因型： ama+tsc +amb 24、su-寄主中的菌斑必定有2种基因型（三）（三） x174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图亲 本基因 型： ama+tsc +amb su-寄主中活：必定是ama +tsc与+ amb +交换产生野生型活 体基因 型：野生型活体必有+ + tsc 和+ + +两种基因型ama+amb+tscama+amb+tsc+ama+ amb+ tscama+ amb+ tsc+253、据优势菌斑种类确定中央基因（三）（三） x174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图 42下ama+amb+tsc基因型为小斑，

18、+为大斑ama + tsc + amb + + ts + ama tscamb + + + ts小菌斑占优势，是b居中央 因b居中时ab基因间仅1次单交换产生小斑+tsc，但a居中时ab基因间需双交换才有小斑+tsc，故b居中央。 ama + tsc + amb + + + ama tsc amb + + +大菌斑占优势，是a居中央 因a居中时ab基因间仅1次单交换产生大斑+，但b居中时ab基因间需双交换才有大斑+，故a居中央。264、三点作图举例 amatsc +与 +amb成对感染su+e.coli， 5 106倍稀释液平板接种1ml产生88个菌斑；裂解后5107倍稀释液接种1ml 到su

19、- e.coli培养，30培养12h后45培养，产生13个大、7个小菌斑，求rf(a-b)、 rf(a-tsc),=? 并作图。解：总配子=885106，a-b重组配子=(7+13)5107 基因定序：42下大菌斑占13/20，则ama在中央 rf(b-a)=(重组配子数2）/总配子数 =（220510-7 ）/(88510-6）=4.5% rf(a-c)= (2 510-7)/(220510-7)=35tsc 35amb4.5 ama 绘图：（三）（三） x174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图27五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组(specific re

20、combination)1. 噬菌体基因组p204p204 通过重组、互补测验和测序研究，证明基因组有48502bp,61个基因。其中32个重要基因可分为2类：必需类24个基因，非必需类8个基因。即：28五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组2. 正常整合与切除p206p206 噬菌体仅能在ecoli基因组gal 和bio基因之间插入称整合。在int基因编码的整合酶作用下，附着位点attp与ecoli附着位点 attb 结合、交叉、整合，进入ecoli基因组。 在xis基因编码的切除酶和整合酶共同作用下， 能从ecoli基因组内环去。细菌bob接 pop呈bop , pop接细菌bob呈po

21、ba末端酶基因 j尾部基因n反终止基因r宿主裂解酶 29五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组3. 异常剪接 几乎始终从ecoli基因组内精确环去，但偶而也发生异常剪接。丢失必需基因环去时产生活性、非活性缺陷。从gal到尾部形成基因j之间异常环出，丢失了attp必需基因，为非活性缺陷型 dbio 从成斑基因n到bio异常环出，丢失attp与n之间非必需基因，多为活性缺陷 dgal。30 phage与ecoli附着位点中有相互识别的核心序列能联绘-dna pop 240bp核心序列o：15bp，富含a-t，非对称序列左序列p：160bp, -1600右序列p：80bp， 080e.coli b

22、ob 23bp左序列b：-11 0右序列b：0 11核心序列o：与o相同pop与bob相互识别(attp)核心序列与b(attb)相互识别五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组3. 噬菌体整合切除机理p207p20731第第8章章 作业及复习题作业及复习题一、作业：一、作业：p2135.9 二、复习题二、复习题（一）名词注释（一）名词注释1. prophage2.nonsense mutation 3.suppressor- nonsense mutation plementation test 5.recombination test （二）填空（二）填空1.噬菌体(a+)与(+b)杂交，在e.coli k株内产生2.7%野生型，则rf(ab)=( ）。5.噬菌体转导a,b基因共导率愈高，说明a b基因的遗传距离愈（ ），cm值会愈（ ）。2、基因内不同位点间有结构差异的基因称为拟等位基因，基因内不同位点间的排列方式被称为（