DNA测序仪原理及应用

1、DNA测序仪的原理及应用上海交通大学分析测试中心 侯敬丽内容 DNA测序原理 CEQ8000 DNA测序仪基因测序系统的应用引-基因组DNA:染 色体-质粒DNA:细菌 细胞-线粒体DNA:胞浆A adonlm T" ttwmhB G guinhsCHG3rtoalno-人工染色体DNA:BAC YAC一 cDNA双脱氧链末端终止法1977年，Sanger人发展建立起来的一种DNA 测序方法。基本原理：双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂一类似 于正常dNTP的2,3，双脱氧核昔三磷酸(ddNTP),将 延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单 链模板、引物、4种dNTP和DNA

2、聚合酶。共分四 组，每组按一定比例加入一种(ddNTP),它能随机 渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各 种不同大小片段的末端核昔酸必定为该种核昔酸， 可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核昔酸序列。Sange啲酶降解测序法（涟终止法）这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物（才3 一双脱氧核昔三磷酸ddNTP）的特异性终止进行DNaW序。ddATP ddC I P ddG I P ddrTPDNAHACGT A A ATC<iA f ACGT A A Id<J A上丄1丄丄丄丄i丄i .| | | | | | | | | | | | | | | | | |

3、| WWDNAACGTAXATCGATACGTAATCATTA 1111 u UklJIliyddAlP ddCI I* dd<i I P ddl IPUNA* CIW(Klcnou)dN I P 0H II ddN I P©-©-KD-CH/>44U<A.C.G.r>0双脱氧链末端终止法测序基本原理示意双脱氧链末端终止法特点双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的 优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有 一个纯淳的单链DNA模板和一个合成皮应所需的才寺 异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬 菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶 解片段

4、为引物，在模板链的不同部位引导合成， 从而确定岀噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大 量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备 产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧 链末端终止法的应用程度。经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进标记物方面的改进：由于放射性同位素对人 体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质 来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银 染法、荧光标记物等化学发光物在双脱氧法 测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产 物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示岀 测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素 方法检测容易、安全、快速、费用也低。经典的双脱氧链末端终止法测序技术的

5、改进电泳方法的改进：电泳方法的改进主要采用毛细 管电泳法。毛细管电泳是被分离物质在毛细管中 的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管 电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只 毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出 350bpo DNA序列分析效率可达6000bp/h。DNA测序仪测序原理DNA polymerase+引物4-dCTPdATPdGTPdTTP漆-ddCTP | -ddATP* -ddGTP# -ddTTP三三二三三三_ICCATHACC1A1CCATT 人双脱氧链末端终止法测序基本原理示意G A T CSanger DNA测序仪的发展历程7977: S

6、anger DNA法测序概念被提出1986: Hood and Smith荧光标记ddNTP被用于电泳1987:第一台自动测序仪产生1990:毛细管电泳被应用在DNA测序上2003:人类基因组测序工作完成CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCEQ8000 DNA测序仪CEQ8000DNA测序仪硬件预览Capillaries (8)Cannula end orElectrode Block(inlet)Array Filling(outlet)PMT3Ietection wiInjectAutomatedliTSieVWFilter wheelLoadfUnload P

7、latesSample Denaturation and InjectionBeckman CEQ8000 Start menu； Main Menu - Version 9.0M l ll lCEQM 8000Genetic Analysis SystemBECKMAN COULTER®SET UPoRUNA WkiffiA <5 - C ：, A 4SEQUENCINGINVESTIGATORFRAGMENTSDATABASEView a SEQ ResultAlignmentAnalyzed DataQuality ParametersBase SequenceRaw D

8、ataCurrentVoltageCWH PE2J6CTCuClC« ««V；cc : TT-190179 ZbB 357 446 535 624 713TTXZrOlGTCCCAAGCTTOATCOTTIXAGGTCGACTZTAGAGGATrcCOSGGTPjZCGAGCTOSWTDZCTrAATCATITDZAmGCTCTIT CCTOTCTCAATT5TOT3C(X：T3AaTTOCACACAACATACGlXCGGAAGCATAAAGTyrAAAGCCDj(5GCTGO3TAAT3AOTGkG CTAACTC 沁 TTAATTGCGTOSCGCICACT

9、CCCCGCTTTCGG 叱 GGGAAACCMTOSTCCgGCTGCATTAATGATVTCGGCCAACGCG CGGGGAGAGGCGGTTTCCGgTrcGGCGCraTBXGCTrcCTCGCTVACreACmGCrcCGCrcGGWGTTCGGCTGZGGCGAGCGGTA TCAGCTCACKrWAGGGIATACGGrrATCCACAGAATCAGGGGAIAAOSCAGGW.GAACATCTCAGCAAAGGCCAGCAAAAGrSC CAGGRCO3TAAAAAGGCCGO3TTGCTGGCCTTrrK：CEGGCirCG<X(XCCTGW：GRGCAT”UAAAA

10、ATCGAO3CTCWGK：AGA 6GTCGCGAAACCO5ACA© ACDSTACCTCTTCCa CCmXAGTTlWGGTVTTi2T»?心3抚 0MOODataPortr<X»HO1201«MO4?0OTOAXiATTOITftTCCftCTCftCAATTCCACXiCAACATACOA6CC66AA6CArAjCiftOTn7AjCiAGCCT600nT6CCTAA7HAGTOAGC±JAnalyzed Data22R3 刃 £ 刃, nsn 433221100±l190119269质粒和PCR产物测序

11、!)WCO$!g1 r t( C rT CC TO? CTC ( T 'CT(b CT6CGCTC '： TCv TIC " (9TTCCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTTVkTCATGTCATAGCTGTTT CCTGTGTC?JTTCTTATCCGCTCACPJTTCCACAC7CATACGAGCCGGAP.GCAT?J.GrrcTAAP.GCCrrcGGGTCCCTAATCAGrrcAG CTAACTCACATTAATTSCGTTGCGCTCACTGCCCGCTT

12、TCCAGTCGGGAJkCCTC'TCGTSCCAGCTGCATTAATGAHTCGGCCAACGCG CGGGGAGAGGCGGTTT3CGTATT3GGCGCTCTTCCGC TTCCTCGCTCACT3AC TC GCTGCGC TC GGTCGTTCGGCTGC GGCGAGCGGTA357 TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCRCAGAATCAGGGGATAACG<ZAGGAAAi3AACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC 446 CAGGAACCGTAAAAAGGCC GC GTTGCTStSC GTTTTTC CAT

13、AGGCTC CGCCCCC CTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGA 535 GGTGGCGAAACCCGACAGGACIATAAAGATACCAGGCGTTT2CCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCKrCTGTTCCGACCCT3CCGCIT62 4 ACC I3GATACCTGTC CGCCC TTTCTCCCTTC GGGAAGCGTGGGCGC CTTTCTCATAAGCCTCAC GCCTSTTtAGGGTATTC TCAAGTTTC 713 GGGTGTTAAGGGTC GTTTC UGCCTCCCAAGGCCT2GGGC CTSGTG

14、TTGCACCGAAA仪器性能CEQ基因分析系统是一个全自动的系统，能够测定经过 Beckman Coulter染料标记试剂处理的DNA样品的碱基序列和 片段长度。四色染料标记终止反应试剂盒用于对样品进行碱基 序列分析。染料标记引物则用于对样品产生的片段长度进行分析。 CEQ8000可一次接受1个96孔板。包括标记DNA片段的每 排8个样品（样品设置）自动变性，接着被毛细管电泳分离。 每次分离之后，在8根毛细管中的可替换媒介（分离胶）都被 自动替换。分离胶是由一个容易替换的胶管供给的，它能有效的 供应1块96孔板。检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的。分离之后， 8根毛细管中的每根产生

15、的原始数据信号都自动处理产生高质量 的碱基序列或片段序列。原始数据和分析数据储存在数据库里， 都能够以与普通分析应用程序兼容的格式输出。1. 分离纯化模板DNA*2. DNA模板定量分析*3. 测序反应*4. 测序反应后纯化*5. On-line变性*6. 毛细管电泳和检测*7. 数据分析*分离纯化模板DNAi）应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到 相应的质粒模板或者PCR产物；2）将DNA储存在灭菌水里如ddH20, 18.2M QH2 0超纯水；注意:不要使用DEPC处理的水,水中不能有 EDTA,否则将抑制测序反应3）通过紫外分光光度计定量DNA模板，DNA模 板的浓度应该O.lug

16、/ul；4）通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。准确定量DNA模板是测序反应中十分重要的一步测序反应SequencingStep 1 : denaturationTrrnirnniiiiiiiiHHiiiiiiiiiii |肝0701111叩山|山币| in I 川niStep 2 : annealing1 primer !3'mixture of dNTP's I and ddNTP*s |M Ar»dy Vx«v»Cr »ele 19S»9>Step 3 : extension测序反应后纯化去掉反应产物中的dNTP

17、.ddNTP和盐分乙醇沉淀俐用96孔板离心机）测序反应后纯化测序反应后纯化Mg+Mg+TCACGTCTTGGCAATCGCGGTCTCTCTCTTGGCAATCG1CGCTCT；tiMg+CTCTTGGTATCCTOAGAGTo（；（aTC«WKACGTCTTGGCAATCGctciggcaatcgtcHTCTTGGCAATCG测序反应后纯化纯化得到DNA测序反应产物AG C C TC AG C C AGTC AG AGT G ©A!g SOCCfTCAGQOAG TCWG AG T)QxC：fS| AG>©ctCIAIGxOOAGT©A©

18、;IAGTgcA AG C C TC AG C C AGTC AG AGTG( AGQ CTICiAGCCAGlTCAGAGT AG©©T©Ad©©jAOIT©AIGJAOj|DNA测序仪检测伽 GQUiXGMCfflXS如 G" GO AiG* ajGQORU 莎 GOCiAOaDUiffiGtAJOiTGCAI MXi>O-CaC(®G>C«C«<O>T<COTOfl&G»T-O-«cHH AO-C<C»TIC AjG

19、-CC AG TtC jAC AQ T G<荧光标记的DNA链按从小 到大的顺序被毛细管电泳 分离。T G C A G A激光诱导的荧光终止剂被 检测器识别，直接阅读DNA 的核昔酸序列DTCS Kits (Store at -20 ° C )Standard Kit一 Sequencing Reaction Buffer 一 dNTP Mix-ddUTP, ddGTP, ddCTP, ddATP Dye Terminators一 Polymerase Enzyme一 Sample Loading Soln (SLS)Quick Start Kit一 Everything mi

20、xed (Except SLS)一 Save time, cost一 Eliminate waste from carry-overTypical Sequencing Result基因测序系统的应用/测序PCR克隆测序验证突变体检测新基因测序全基因组测序系统发育及物种鉴定 个体识别：亲缘鉴定SNP关联分析疾病诊断等PCR克隆测序验证j Sequence Ana|$ 3c3 H07_080812（M7XiQ File Edit View Took Ana处h V/indow Heip-Ifflxl嘲Gi|呂呵匾|糾釧囿 丨刽氐刮冋制 j尿沁|胡，|劇邕阪 H|yj刘利冏也I恋网 刖刨斜 MFI

21、T庆上|壘|A C: G: I: N： r165 129 193 257Elate三|9 3c3.H07 080812047XNew Analysis : UntitledCCTCTAGMAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCGTACTACCATCACC 上 ATCACCATCACCTCGAATCAACPAGTTTOTACAAAAAAGCAGGCTCCACCGCAGGCTCCACCAT GAATAC TTCTATTTCTGAAATTCAGZ GTTTTC TTTC TATGATTGZ TTTTGAGAAAGAGCTC GTC TCAGAAGATTT

22、TAGTOTCGTCGCTGGAATAGATGAAGCTGGAAGAGGGCCACTGGCAGGTCCCG TAGTTGCTAGTGCCTOTATTTTACCTAAGGGAAAGGTATTTCCTOGAGTATIATGATAGTAAGAA _.a ho2>3icc?o%1MK013754653Raw DataAnalysis Ide.rFor Heb.cc© Fl厂NUM ：/ 国 Main Menu Mem 9.0|.矯.Sequence Anol/si» -1.08121| 程22-Part1a ula岂負玉 i：57.am44S<nre（wnut»

23、;i）突变体检测Wild ATGMTACTTCTATTTCTGAAATTCAGCGTTTTCTTTCTATGATTGCTTTTGAGAAAGAG 60llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllMutant ATGAATACTTCTATTTCTGAAATTCAGCGTTTTCTTTCTATGATTGCTTTTGAGAAAGAG 186WildMutantCTCGTCTCAGAAGATTTTAGTGTCGTCGC TGGAATAGAT G1丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨AAG

24、C TGGAAGAGGGCCAC TGIl I I I I I I I I I I I I I I I I I I ICTCGTCTCAGAAGATTTTAGTGTCGTCGCTGGAATAGAigMGCTGGAAGAGGGCCACTG120246新基因测序图位克隆法分离新基因BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库找出候选基因精确定位法检查cDNA测定cDNA序筛选突变体进行功能互补检查cDNA是时空表达列，查询数文库，找出实验，通过转否与目标基特点是否据库，以了DNA序列上化突变体观察因共分离与表型一解该基因的的变化及与突变体表型是致功能功能的关系否恢复正常或发生预期的表型变化全基因组测序

25、细菌、DNA病毒、Cosmid、Plasmid微生物1000多种病毒、135种细菌、16种古细菌的测序已经基本完成动物、植物基因组动物:人类，老鼠，果蝇、丝盘虫、甲虫等 植物：拟南芥、水稻、毛果杨、大豆系统发育及物种鉴定Marine Sciences. 2008, Vol. 329 No. 4, 9研究报告6194981009388Charybdis japonicCharybdis afEnisCharybdis milesCharybdis feriatusCharybdis jaubertemsis1001Charybdis acuta 一 Charybdis helleri Chary

26、bdis truncata Charybdis natatorPortunus trituberculitus Portunus pelagicus Cllinectes sap id us Scylla olivacea ScylLi serrataScylla paramam osain Scylla tranquebainc基于线粒体COI基因部分序列构建梭子蟹系统发育树，研究各 种梭子蟹系统发育和亲缘关系，并且对样品蟹的种类进行鉴定。个体识别:亲缘鉴定2-10 basesVUp to 1000 RepeatsSTR / SSR / VNTR / MicrosatelliteIn all

27、 genomes Human Animals Microbes Plants短串联重复：Short Tandem Repeat (STR)简单序列重复：Simple Sequence Repeat (SSR)可变数目串联重复：Variable-number Tandem Repeat (VNTR) 微卫星序列：MicrosatelliteAnalysis of STR / SSR / Microsatellitepi -innninunnnnP2 *PliiiiiiiiiiiiiiP2" *PCRCEQHeterozygote (Person 1) F2 *Vllllllllllll

28、P2Homozygote (Person 2)PCRCEQSTR微卫星标记的片断分析10001000149.351.-60.51770jo0040-PULSa)AQ2000100200250Size (nt)1000Dye SignalD54 46330.812S262HumanSTR primer247.49Am 408og437.5445OSNP关联分析Single Nucleotide Polymorphism (SNP)单核昔酸多态性：碱基插入、缺失、突变等原因造成Primer Extension Technology:The Genotyping Gold StandardaExtend:Accurate “lock and key55 enzymeDetect:FluorescenceAnneal:Simple PrimerExtensionPrimer Extension TechnologyC/AASNP!CSNP2SNP3SNP检测策略Genomic DNASAP + EkoI3-7r C 1 hour and 75X 15 minPCR amplified product withfree primers