液相色谱仪的使用2谷风书屋

1、1实验十二 液相色谱仪的使用 实验时间：2004年12月25日     第三组：周炜     学号：02321013 一、实验目的 （一）掌握waters hplc的基本结构及工作原理； （二）了解waters hplc的性能特点及应用范围； （三）熟悉waters hplc的操作步骤。 二、基本结构及工作原理 高效液相色谱法（hplc）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的

2、重要手段。高效液相色谱法包括四种基本类型：分配色谱（pc）、吸附色谱（ac）又称液固色谱（lsc）、离子交换色谱（iec）、尺寸排斥色谱（sec）又称凝胶色谱（gc）。 （一）基本结构及工作流程 高效液相色谱仪可分为4个主要部分：高压输液系统；进样系统；分离系统；检测系统。此外还配有辅助装置：梯度淋洗装置；自动进样装置；数据处理器等。其结构示意图如下。 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 （二）分配

3、色谱法的基本原理 分配色谱法是四种高效液相色谱法中应用最广的一种，它的原理类似于溶剂萃取。一般将分配色谱分为液液分配色谱（llpc）和化学键合相分配色谱（cbpc）两类。本实验采用化学键合相分配色谱法。 1.液液分配色谱法 在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，还是离子型的和非离子型的化合物。液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分

4、离各种复杂组分。 2.化学键和相分配色谱法 化学键合固定相是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。 三、性能特点及应用范围 （一）高效液相

5、色谱仪的特点及应用范围 高效液相色谱仪是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 1.分离效率高：使用新型填充物,粒度可小于50微米,每米色谱柱的塔板数达5000以上。 2.分离速度快：采用高压输液泵，流动相压力高达300千克力/厘米2以上,流速远比经典液 相色谱法为快，分离速度可与气相色谱法相比。 3.灵敏度高：流出液流经紫外或荧光等检测器，可直接检出低至10-1310-10克的物质。 4.应用范围广：可以测定高沸点、热不稳定等不宜于用气相色谱法测定的大分子量的化合物。环境中的

6、一些致癌物质如黄曲霉毒素、多环芳烃以及除莠剂、杀虫剂等都可以用高效液相色谱法进行快速、灵敏的分析测定。大气飘尘的多环芳烃从两环的萘至五环的苯并(a)芘等10多种化合物，在半小时内便可分离测定。应用紫外检测器可以检知含量为纤克米3级的多环芳烃。 正是因为高效液相色谱法具有如此多的优点，所以又被称为现代液相色谱法、高雅液相色谱法、高速液相色谱法。 作者： 化学小朋友   2005-4-8 13:24 回复此发言   2实验十二 液相色谱仪的使用 （二）waters hplc各部件的性能特点 waters breeze hplc系

7、统 是一套在简洁、高性能、可靠性和价位平实之间取得平衡的，能广泛适用同时易用的hplc系统。此外，本系统是非常灵活的，可以定制部件来适应用户的应用需求。breeze系统的部件列表如下。 最低计算机需求 intel赛扬600mhz或更高，256mb内存，有pci插槽和足够空间以便插入bus lac/e卡  微软windows xp专业版，8 gb硬盘，svga显示器，4x cd-rom驱动器  1.44 mb软驱，3.5英寸  支持微软windows xp专业版的打印机 仪器控制 适用于单系统 

8、1500系列hplc泵  2487双波长紫外/可见检测器  2414示差折光检测器  717plus自动进样器  1500系列柱温箱  bus sat/in（采集waters检测器的数据） 采集 最多五个检测器通道 数据能力 处理（lc&gpc），报告和存储数据结果 数据输出格式 pdf, emf, aia, ascii, e-mail  1.breeze软件 适用于无需二极管阵列检测器的用户；集泵、检测器、进样器的实用功能于一身；易用的界面，方便的仪器控制，最低的培训要求，提

9、高使用效率。 2.1500系列色谱泵 waters 1500 hplc系列包括等度和高压梯度色谱系统，其中梯度系统包括三种规格：1525分析型，1525低流量型和1525ef分析兼半制备型。整体式hplc系统，使用灵活方便；专利非圆齿轮技术，具有极佳的耐用性和输液稳定性；汲取waters技术精华，具有高流速精度。 3.717plus自动进样器 全电子设计的自动进样器，高精度、高可靠性； 进样针内、外清洗设计，最大程度降低交叉污染； 样品室温度控制选件，保证热不稳定样品之完整性。 4.2475双扫描荧光检测器 全新设计，优化信号强度，降低散射光，减少池体扩散，大大提高检测灵敏

10、度； 激发和发射波长均可扫描，允许自动增益优化； 波长编程功能设计，允许不同保留时间的化合物使用不同波长检测，优化各个被测物的检测灵敏度； 在线波长准度确认及增强安全性设计，符合严格的法规要求。 5. 6. xterra色谱柱 xterra色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限。广泛适用于分析、制备领域。杂化颗粒技术利用有机/无机杂化颗粒来发挥硅胶和聚合物基质填料的优势，克服了传统填料的弱点，为研究者优化分离速度、分离度、ph选择性、色谱柱寿命及上样量提供了强有力的工具。杂化颗粒填料具有分离效率高、峰形优异、稳定性好、ph 范围宽(1-12)及规格齐全等特点。xterra

11、 色谱柱提供了 hplc 分离速度与分离度的最佳组合，为研究者提供最宽范围的分离键合相、色谱柱规格以及颗粒度。xterra填料目前提供 2.5m，3.5m，5m 和 10m 四种粒径及msc18，msc8，rpc18，rpc8和苯基五种键合相。 四、实验内容及操作步骤 （一）仪器、试剂及色谱条件 1.仪器：waters hplc、荧光检测器、25l微量进样器。 2.试剂：萘标液（国家标准物质中心；200mg/l）、甲醇（分析纯）。 3.色谱条件 （1）c18色谱柱：长15cm、内径4.6mm、填料粒径5m； （2）

12、流动相（甲醇）：1ml/min； （3）荧光检测器：280/334nm。 （二）参数设置及操作步骤 1.准备工作 （1）流动相：过滤（0.45m滤膜）、按比例混合、超声510min除气泡； （2）使用前（后）冲洗：进样口（load、inject）、泵、柱、检测器； （3）标样、样品：都需要过滤。 2.开机及测试样品 （1）先打开色谱仪、检测器；后打开电脑及软件； （2）选project、use name； （3）manage breeze看system，连接情况； （4）view method设参数：如波长、流速（1.0）、溶剂（甲醇：水）等；保存； （5）检查：

13、流动相放好、使用a泵或b泵； （6）灌注、冲洗：用流动相充分浸润泵，排除气泡； （7）平衡系统：equilibrate选择方法、平衡20min左右； 作者： 化学小朋友   2005-4-8 13:24 回复此发言   3实验十二 液相色谱仪的使用 （8）进样：make single injection、next、取样、出现对话框后、在load注入、马上移到inject、拔出进样器；2min后将inject拨回load；停止按stop。 3.数据处理 （1）设定process parameter：find data

14、在channel中选一个数据、点review、点guide、选start、选峰的范围（用鼠标拉）、next、next、在peak1命名、next、next、选external给process parameter起名（可以是仪器参数的方法名或重新起名）、finish、保存； （2）设标准曲线横坐标：find data中选所有要做标准曲线的点、右键alter sample、把unknown改为standard、点edit中component、点edit中copy、选过程方法、填写每个点的浓度、ok、保存； （3）做标准曲线：find data中选所有要做标准

15、曲线的点、右键process、选过程方法、选clear、ok、右键view as中result、选所有要做标准曲线的点（看时间、是刚刚生成的）、右键review、点校正曲线、查看信息； （4）定量分析：find data中选样品点、右键process、选过程方法、选useluo、ok、右键view as中result、选数据点（看时间、是刚刚生成的）、右键review。 （三）注意事项 1.流动相过滤、配比、超声除气须严格按操作规程； 2.打开、关闭泵时，要控制流动相的流量以多次小幅度增减，以保护色谱柱； 3.做完实验后，要用甲醇（水）交替冲洗整个流路（包括进样口

16、） 五、实验记录及数据分析 表一：标准曲线：                                      浓度(mg/l) 峰面积 0.64 92159 1.6 230361 6.4 981788 表二：未知样测定：

17、 未知样浓度(mg/l) 峰面积 第一次 3.467 525835 第二次 3.002 453696 第三次 3.691 560635 平均值 3.387 513389 六、实验讨论 （一）高效液相色谱法与经典液相色谱法及气相色谱法的比较 高效液相色谱法（hplc）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 高效液相色谱法与经典液相色谱法比较： 高效液相色谱法

18、比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1。例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的lichrosorbods(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。 高效液相色谱法与气相色谱法比较：  （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。   (2)气相色谱采用流动相是惰性