微生物检测技术实验

1、海 南 大 学实 验 教 学 自 编 教 材微生物检测技术实验农学院生物技术系编实验一 细菌学鉴定中常用的生化反应实验一、目的要求了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。二、基本原理微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物。生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。IMVIC是吲哚（indol test）、甲基红（methyl red test）、伏普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个试验的缩写，i是在英文中为了发音方便而加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产

2、气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。色氨酸水解反应：吲哚与对二甲基苯甲醛反应：大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，

3、如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸、但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。伏普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性未端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧

4、化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。其化学反应过程如下：产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加人1溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.07.0时为绿色，pH大于 7.6时呈蓝色

5、。硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。三、器材1、菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌。2、培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。蛋白胨水培养基:蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.6,121灭菌20min。葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，水1000mL，调pH 7.2，分装，1

6、21灭菌20min。柠檬酸盐培养基：NH4H2PO4 1g，K2HPO4 1g，NaCl 5g，MgSO4 0.2g，柠檬酸钠2g，琼脂15-20g，水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液 10mL，将上述试剂加热溶化后，调pH 6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤，分装，121，20min灭菌后制成斜面。注意不要过碱，以黄绿色为准。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121灭菌20min。醋酸铅培养基：pH 7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%的醋酸铅水溶液1mL。将牛肉膏蛋白胨

7、琼脂加热溶化，待冷至60时加入硫代硫酸钠0.25g，并调pH7.2，分装于三角瓶中，115灭菌15min，取出后冷至60，加入10%的醋酸铅水溶液1mL，混匀导入试管。在配制柠檬酸盐斜面培养基时，其pH不要偏高，以浅绿色为宜。吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白水解素得到的蛋白胨较好。3、溶液或试剂：甲基红指示剂，40KOH，5萘酚，乙醚，吲哚试剂等。四、操作步骤1、接种与培养（1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置37培养48 h。（2）将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基（吲哚试验），2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲

8、基红试验和伏普试验），2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中，置37培养2 d。2、结果观察（1）硫化氢试验：培养48 h后观察黑色硫化铅的产生。（2）吲哚试验：于培养2d后的蛋白胨水培养基内加34滴乙醚，摇动数次，静置l3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加人2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。配制蛋白胨水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋自酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。（3）甲基红试验：培养2d后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳胜，变黄色者为阴性。注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。（4）伏

9、普试验：培养2 d后，将另 1支葡萄糖蛋白陈水培养物内加人510滴40KOH，然后加入等量的 5萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温 1530min，以加快反应速度。若培养物呈红色者，为伏普反应阳性。（5）柠檬酸盐试验：培养48 h后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。五、实验报告1、结果将实验结果填人下表。“”表示阳性反应，“一”表示阳性反应。菌名IMViC试验硫化氢试验吲哚试验甲基红试验伏普试验柠檬酸盐试验大肠杆菌产气肠杆菌对照2、思考题（1）讨论IMViC试验在医学检验上的意义。（2）解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存

10、在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？（3）为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？（4）说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅？实验二 水中细菌总数的测定一、目的要求1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2、了解水源水的平板菌落计数的原则。二、基本原理本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总

11、数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、器材1、培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121灭菌20min。2、仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤1、水样的采取（1）自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼 3min灭菌，再开放水龙头使水流 5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。（2）池水、河水或湖水：应取距水面1015 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻

12、璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2、细菌总数测定（1）自来水 用灭菌吸管吸取 lmL水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 分别倾注约15 mL已溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15 mL，作空白对照。 培养基凝固后，倒置于37温箱中，培养24 h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为 lmL水样的细菌总数。（2）池水、河水或湖水等 稀释水样：取 3个灭菌空试管，分别加人 9 mL灭菌水。取 lmL水样注入第一管9 mL灭菌水内

13、、摇匀，再自第一管取lmL至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。 自最后三个稀释度的试管中各取 lmL稀释水加人空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 各倾注 15mL已溶化并冷却至45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 凝固后倒置于 37培养箱中培养 24 h。

14、3、菌落计数方法（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。（2）首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表21，例1）。（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数（

15、见表21，例2及例3）。（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表21，例4）。（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表21，例5）。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表21，例6）。表21 计算菌落总数方法举例五、实验报告1、结果（1）自来水平板菌落数1mL自来水中细菌总数12（2）池水、河水或湖水等稀释度101102103平板121212菌落数平均菌落数计算方法细菌总数/mL2、思考题（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用

16、水的标准？（2）你所测的水源水的污秽程度如何？（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度、培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？实验三 多管发酵法测定水中大肠菌群一、目的要求1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。二、基本原理多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。l、初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白陈液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养

17、基即由原来的紫色变为黄色溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。水样接种于发酵管内，37下培养，24 h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下地可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48 h后仍不产气的为阴性结果。2、平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endos medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar，EMB

18、 agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管 24 h内产酸产气和 48 h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。3、复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再

19、进一步证实。原理与初发酵试验相同，经 24 h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。三、器材1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1.6的溴甲酚紫乙醇液1mL，水1000mL，将蛋白胨，牛肉膏，乳糖及NaCl加热溶于1000mL水中，调pH7.2至7.4，加入溴甲酚紫乙醇液1mL，混匀，分装，115灭菌20min。伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g，NaCl 5g，K2HPO4 2.0g，2%伊红水溶液20-30mL，0.

20、65%美蓝水溶液10-15mL，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4,121灭菌20min。2、仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤1、水样的采取同实验二。2、自来水检查（1）初（步）发酵试验：在2个含有50 mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加人100mL水样。在10支含有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10mL水样（如图31）。混匀后，37培养 24 h，24 h未产气的继续培养至 48 h。（2）平板分离：经24 h培养后，将产酸产气及48 h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37下培养1824 h，将

21、符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 深紫黑色、有金属光泽。 紫黑色、不带或略带金属光泽。 淡紫红色、中心颜色较深。（3）复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落l3个，37培养 24 h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表32，即得大肠菌群数。图31 多管发酵法测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释3、池水、河水或湖水等的检查（1）将水样稀释成10-1与10-2。（2） 分别吸取 lmL 1

22、0-2、10-1的稀释水样和 lmL原水样，各注入装有 10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。（4）将100、10、1、0.1（10-1）mL水样的发酵结果查表32，将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）mL水样的发酵管结果查表33，即得每升水样中的大肠菌群数。表31 大肠菌群检数表接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）表32 大肠菌群检数表接种水样总量111.1mL（100mL、10mL、1mL、0.1mL各1份）“”大肠菌群发酵阳性；“”大肠菌群发酵阴性表33 大肠菌群检数表接种水样总量11.11mL（10mL、1mL、0.1mL、0.01mL各1份）“”发酵阳性；“”发酵阴性五、实验报告1、结果（1）自来水 100mL水样的阳性管数是多少？10mL水样的阳性管数是多少查表31得每升水样中大肠菌群数是多少？（2）池水、河水或湖水阳性结果记“；阴性结果