九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制

1、2-6 weeksmean of 10 yearsAsymptomatic phaseFlu-likeDiseaseSymptom-atic phaseAIDS10005002000CD4 T cells/m mlInfectionSeroconversionDeathCD4 T cell depletionHAART 成人及青少年艾滋病分期标准（成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，美国，1993年）年） CD4200/ulCD4200/ul和和/ /或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中等）时，就可定义为进

2、入艾滋病期。如表中A3A3，B3B3，C1-3C1-3期。期。HAART治疗6 个月 1 0 例患者 CD 4 细胞平均数 变 化HAART治疗6 个月 1 0 例患者 CD 4 细胞平均数 变 化2662663093093333331651650 05050100100150150200200250250300300350350d0d04w4w12w12w24w24w治疗时间治疗时间CD4细胞数（个/ u l ）CD4细胞数（个/ u l ）10例患者治疗期间平均VL的变化情况0123456d04w12w24wVL log copies/ml提提 示示CD4+ T细胞计数的方法细胞计数的方法

3、非非FCM 技术技术FCM 技术技术-自动化方法自动化方法-可靠性高可靠性高(变异系数低变异系数低)-精密度、准确度和可重复性高精密度、准确度和可重复性高-高通量高通量-金标准技术金标准技术优点优点-设备昂贵设备昂贵-试剂昂贵试剂昂贵- 需要熟练技术人员操作需要熟练技术人员操作缺点缺点-简单简单-低廉低廉优点优点-低通量低通量-难于质控难于质控缺点缺点BD FACSVantageBD-Calibur 对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选（3）高通量（分析分选） 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒 流体动力学聚焦流动室激光聚焦1、液流系统包裹样本流使之位于喷嘴中心二色镜

4、1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。2、光学系统：激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）颗粒度细胞大小散射光信号区分裂解后的外周血细胞群荧光染料被激发而发射的光信号 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量线性放大：信号强度变化范围较少、生物学线性过程对数放大：信号强度变化范围较大、光谱信号复杂自发荧光特异荧光特异荧光CD45 FI

5、TC (log)CD14 PE (log)G2流式细胞技术流式细胞技术传统的传统的FCM: 双平台法双平台法-需要两台仪器需要两台仪器-需要几个制备和分析步骤需要几个制备和分析步骤-分析能力低分析能力低-结果受多个因素影响结果受多个因素影响-昂贵昂贵传统的传统的FCM: 单平台法单平台法-只需一台仪器只需一台仪器-较少的制备和分析步骤较少的制备和分析步骤-非常昂贵非常昂贵美国美国CDC 推荐推荐 (2003)单平台测定CD4+ T 细胞绝对数指南- FDA 批准的商业荧光微球计数试剂批准的商业荧光微球计数试剂 - 以以 CD45 设门设门- 三或四色流式细胞仪三或四色流式细胞仪三色组合三色组合

6、 1) CD3/CD4/CD452) CD3/CD8/CD453) CD3/CD19/CD45四色组合四色组合 1) CD45/CD3/CD4/CD82) CD45/CD3/CD19/CD16 和和/或或 CD56FACSCaliburTM 系统系统选配选配BDB Tritest/TruCOUNTTM 试管试管WWW.BDBIOSCIENCES.COM50 L 抗凝全血抗凝全血 涡旋室温避光孵育15分钟获取和分析获取和分析20 L TriTEST 试剂试剂450 L FACS溶血液溶血液 (1x)TruCOUNT TM 试管试管TriTEST 试剂试剂: a) CD3/CD4/CD45 , b

7、) CD3/CD8/CD45室温避光孵育15分钟 细胞亚群的细胞获取数 Beads 总量 细胞亚群的 X = Beads获取数 样本量 (l) 绝对数（细胞数/ l）CD45 PerCPSSCBDB MultiSETTM 软件软件MMWR, 2003: 52(RR02);1-13CD4绝对计数结果绝对计数结果内置微处理器实现数据自动分析自动打印质控与病人的检测结果简单易用的系统控制面板配套的样本制备工作台简捷的样本制备方法，避免细胞损失BDB FACSCountTM 系统系统报告项目自动设定分析区域自动设定分析区域CD3 SizeCD3 CD4内参微球内参微球设定分析群体设定分析群体CD3 C

8、D4CD3 CD8CD8 管分析管分析绝对计数公式绝对计数公式CD4 细胞数细胞数内参微球数内参微球数X# 获取微球数获取微球数 m mL 全血体积全血体积=CD4 细胞细胞m mL 全血全血举例举例# 2# 1X# 获取微球数获取微球数 m mL 全血全血=CD4 细胞细胞m mL 全血全血CD3 CD4绝对计数计算绝对计数计算CD4质控微球质控微球室间质评室内质控International Program for Quality Assessment ProgramType of sampleNumber of participationsSendouts per yearSpecimen

9、s per sendoutCostStandardization for Lymphocyte ImmunophenotypingandWhole blood HIV-Whole blood HIV- (some CD4 depleted)Whole blood HIV- (some CD4 depleted)Whole blood HIV- , HIV+UKNEQASQASICAPNIAID DAIDS1630064223515070080$ 820No cost$ 650No cost使用稳定的人血对照作为淋巴细胞免疫分型的内部质量监控使用稳定的人血对照作为淋巴细胞免疫分型的内部质量监控产

10、品名类型已知检测范围制造商Multi- Check全血YesBDBCD- Chex Plus全血YesStreck LaboratoriesCD- Chex全血YesStreck Laboratories( BDB)( BDB)FluoroTrol全血YesBioErgonomicStatusFlow全血YesR&DCyto-Trol单核细胞(冻干)YesCoulterCD3+4+ Absolute Count IMMUNOTROL 624cells/ul (+/- 165)30040050060070080013579111315171921232527293133353739dates runcells/ul系列1系列2系列3系列4系列5系列6 * 吸取蒸馏水称量v 仪器参数可以由仪器参数可以由FACSComp 和和CaliBRITE TM 微球微球, 仪器调仪器调控软件自动设置控软件自动设置.FACSCalibur校准校准 CD3+4+ Absolute Count IMMUNOTROL 624cells/ul (+/- 165)30040050060070080013579111315171921232527293133353739dates runcells/ul系列1系