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文档简介
1、采血装置改进核酸调控领域的发明摘要方法和装置用于稳定的生物样品分析,包括通过样品采集装置从受试者获得生物样品的步骤;这个生物样品包括从受试者获得的至少一个循环游离第一核酸。该方法可包括当样品收集装置具有保护组合物包括防腐剂,一个可选择的抗凝血剂和猝灭剂,以形成包括所述保护剂组合物和样品的混合物接触生物样品的步骤。1. 本文的教导涉及的装置和方法用于稳定和保持游离的DNA ,而不会损坏DNA完整性的改进保护和调控核酸物质在收集,储存和运输的过程中。背景介绍2. 游离的DNA ( cfDNA )天然存在于血并已在很大程度上归因于凋亡和坏死的过程。而血液中的cfDNA在1948年被发现。其在临床医学
2、方面的影响并未实现超过二十年。具体地的说,cfDNA被证明存在于系统性红斑狼疮患者的血清中,cfDNA水平在癌症患者的血清中被提高。这些调查结果激发cfDNA在疾病诊断的潜在的兴趣。调查进行了类风湿关节炎,大肠癌,乳腺癌,胰腺癌,头颈部癌症患者都显示cfDNA浓度明显上升。该cfDNA提取自癌症患者的血浆或血清,呈现出典型特征的肿瘤DNA ,并且可以充当非侵入性生物标记用于癌症检测和管理。3. 有日益增长的兴趣在游离胎儿核酸的产前诊断的潜在用途。Lancet是第一个展示出怀孕的供体血液样本具有较高的产妇cfDNA浓度也证明了胎儿cfDNA在孕妇血浆中的存在。临床应用涉及了胎儿cfDNA分析,包
3、括了性别判定, 单基因紊乱,妊娠相关疾病和非整倍体检测。4. 从那时候开始,研究累积体内确定cfDNA是多种致病条件的预测和诊断指示灯; 如癌症相关遗传和表观遗传改变,胎儿DNA突变和产前诊断,和病毒感染-通过检测人体血液中的病毒DNA。因此。精确检测cfDNA人类生物标本正在成为主流,非侵入性的途径允许评估,审查和疾病分类和监测临床分析。5. cfDNA归因于DNA片段的可检测的多种体液。血浆或血清最常用于此目的,但是,存在的cfDNA在尿液,唾液,粪便,滑液,脑脊髓液和腹腔液中被检测出来。健康人的cfDNA的平均循环浓度是30ng/ml,cfDNA通常来说是双链的,大约为180-210个碱
4、基大小。CfDNA的检测具有显著挑战是因为一下的原因:1.在产前检测的过程中,主要的产妇细胞材料可干扰胎儿cfDNA检测,2.样品在抽取后加工可以导致细胞裂解,导致异常增加循环cfDNA的量。3. 相关的低水平的cfDNA强调潜在的风险产生假阴性的结果由于缺少目标cfDNA序列由于样品不稳定或不恰当的加工。为此,尽量减少污染的细胞DNA和维护cfDNA已包含的各种预分析因素,如血液收集管的类型,样品储存条件,以及离心协议。例如抗凝血剂如EDTA,肝素,柠檬酸盐和预防的全血凝血细胞,通过减少从白细胞的细胞群的DNA释放。另外,离心分离条件的优化是必需的,以防止裂解而充分从不含细胞的血浆分离单独的
5、完整的细胞。6. 由于cfDNA生物标记的低数量,建议的基因组DNA(gDNA)的背景水平被最小化,以提供精确的测量cfDNA水平。它是进一步有利的cfDNA的结构完整性被保持,由于最小金额可用于分析。因此,有必要解决几个预先分析的问题出现在抽血和随后的DNA提取的过程中。这些问题包括延迟血液处理,血液储藏温度和在运输过程中震荡样品。这样的条件可能改变血浆DNA(质粒DNA )水平通过引起裂解核血细胞释放基因组DNA和混淆真正的cfDNA。因此,它对于考虑血液采集装置的类型和cfDNA样品工作后放血条件是很重要的。7. 以前的努力都集中在化学方法,如使用甲醛基固定使cfDNA的分数浓度变大和延
6、长的后静脉穿刺的时间,一个样品可以被有效的分析。但是研究探讨甲醛的有效性保存全血进行的延长性分析cfDNA浓度在生物样品中已经提供了统计不一致,例如,已经证明,与甲醛一起治疗血液样品后立即抽血对保护胎儿cfDNA在材料中的比例不具有有利影响。8. 因此,有必要需要方法去稳定和保护cfDNA,由此结构完整性被维持和基因组背景DNA被最小化。使运输和储存可能使cfDNA影响最小。有进一步需要这样的方法,其中醛固定的不利影响被避免。发明总结9. 使用本文的教导使用协议使用独特的保护剂组合物成功地保留样品,同时使用多种分析技术在一段长时间内完全稳定DNA。本教导提供了一个一致并有效的方法在血浆里保存D
7、NA。数据展示介绍了一种方法,可降低血细胞裂解,核酸酶的活性,并允许准确和精确的解析分析靠保存的随着时间的推移恢复cfDNA的最后浓度,在这样做时,本教导提供了一种新的方法,提高了cfDNA血浆下游临床分析。本发明防止污染血浆cfDNA 与细胞DNA,这是由内稳定的血细胞从受损细胞释放的一个样本。10. 本教导的描述通过含抑制脱氧核糖核酸酶的活性血浆保护cfDNA。作为有核血细胞的稳定的结果,它不再需要在静脉穿刺后立即分离血浆。此外,样品可以在室温下储存达14天没有对样品的完整性的有害影响,这消除了需要对血浆样品进行冷冻储存。11. 本教导进一步提供了血液收集装置在血浆中减少gDNA的背景水平
8、,当样品受储存和运输条件发生的情况。在一方面,本教导考虑一个方法关于了血液样本的治疗包括定位的保护剂进入血液采集设备。这个保护剂可以包含防腐剂。一个血液样品被抽取到血液采集装置后,血液样品具有第一pDNA浓度。血液采集装置接触血液样品后可能被运输从第一位置到第二位置,至少一部分所述输送发生在温度高于0,抽血后最少24小时才可分离游离DNA,样本具有第二质粒DNA 浓度,其特征在于,在任意统计学显著值方面,所述的第二质粒DNA浓度不大于第一质粒DNA浓度。12. 这里的教导还包括防腐剂可以从重氮烷基脲和咪唑烷基脲中选择。防腐剂在接触步骤之前的浓度为0.1g-3g/ml,游离DNA可以是抽血后至少
9、3天从样品中分离,细胞DNA可以是抽血后至少7天从样品中分离,细胞DNA可以是抽血后至少14天从样品中分离. 样品在抽血后具有第一基因组DNA浓度和运输之后具有第二基因组DNA浓度,在任意统计学显著值方面,第二基因组DNA的浓度不大于第一基因组DNA。在输送过程中没有发生血液样本冻结,温度要低于-30。保护剂接触游离DNA,所以在抽血后最少为期7天的时间内游离DNA的含量要占抽血后血液样品中游离DNA的含量的90%。保护剂接触游离DNA,所以在抽血后最少为期7天的时间内样品中存在的游离DNA的含量要占抽血后血液样品中存在的游离DNA的含量的100%。13. 本文的教导,设想提高保护剂组合物,和
10、稳定用于分析生物样品的方法。保护剂组合物一般包括防腐剂,猝灭剂用来和样品内的DNA反应大幅度降低自由醛,这样的方法可以包括的步骤从血液收集装置中获得生物样品。这个方法可能包括步骤关于接触生物样品当血液收集装置具有保护剂组合物包括了防腐剂,一个可选的抗凝血剂,一个猝灭剂去形成一个混合物包括了保护剂组合物和样品。这个方法可能包括一个步骤关于猝灭任何自由甲醛,可能存在从保护剂组合物中得到的猝灭剂。因此自由甲醛反应生成反应产物使生物样品中的cfDNA变得惰性。最终得到的混合物可能完全不含有任何醛,使样品内的核酸适用于聚合酶链反应和DNA测序。并且基本上没有醛诱导( I)核酸(如DNA)的蛋白质交联,(
11、)核酸(如DNA)与核酸酸(如DNA)分子内和/或分子间交联;或者(i )和( ii)都有,从而形成样品,通过聚合酶链反应(PCR),和DNA测序扩增,由可变数目串联重复序列分析法分析(VNTR),或者两者皆有。14. 从血液中得到样品后,可能有一个从病人抽血到血液收集装置,有保护剂组合物在抽血步骤前被装在其中。这个方法可能包括步骤关于运输样品当其接触保护剂组合物从血液抽取的地方到临床实验室,这将产生一个样品分析。猝灭发生在接触步骤之前或几乎同时发生。这个方法可能包括步骤关于从样品中分离游离DNA。这个方法可能是样品不含任何离心步骤,这个方法可能是不含任何从母血中分离游离胎儿DNA的步骤,这个
12、方法可能是不含任何冷却样品的步骤在接触保护剂组合物之后。15. 如可以从上面所理解的,本教导所提供的含DNA的样品的有利治疗和提供稳定样品那是基本基本上不含可检测的共价修饰抑制PCR扩增,如通过抑制聚合酶结合和伸长率,引物退火和/或DNA染色体嵌入。任何修饰的核酸(例如, DNA ),其可以抑制准确的PCR检测和DNA测序作为保护剂组合物的处理关于目前教导是被延迟至少24,48,或96小时,一周甚至两周的结果。本教导能够取得更大的可预测性,有助于确保任何DNA序列是待扩增或测序也不会被损坏。这提供了一个优势治疗的DNA与甲醛。这就是认为甲醛改性会立即阻止某些基因的扩增和基因数不随时间的增加而扩
13、增。没有预测哪些基因将被第一个修改。因此,临床医生可能无法检测某些特定的生物标志物,和/或其他基因表征(如临界基因突变或缺失而影响胎儿的发育,在游离胎儿DNA的分析的情况下)插图的简单描述16. 图1a显示保护剂组合物在抽血3和6小时对pDNA检测的影响17. 图1b显示根据本文的教导,保护剂组合物在抽血7和14天之后对pDNA检测的影响。18. 图2a显示了在血浆中升高背景gDNA对罕见DNA序列检测的影响19. 图2b显示了在血浆中升高背景gDNA对罕见DNA序列检测的影响以及根据本文教导的示例性保护剂组合物的影响。20. 图3a和3b显示了震动和运输对血液中pDNA浓度的影响,包括了根据
14、本文教导的在标准K3EDTA管中用示例性保护剂组合物对血液采集装置中血液样品进行处理。21. 图4a和4b显示了存储温度对血样中pDNA浓度的影响,包括了根据本文教导的在标准K3EDTA管中用示例性保护剂组合物对血液采集装置中血液样品进行处理。 22. 图5是原理图描述说明潜在的醛(例如甲醛)和基因组DNA样本之间的相互作用。23. 图6a和6b显示了几种模式中的一种的DNA-DNA的交联反应和几种模式中的一种的DNA-蛋白质交联反应。24. 图7a是核磁共振(NMR)读出本文指导的用示例性保护剂组合物对血液采集装置中血液样品进行处理,在82 ppm没有任何的峰,支持了处理的样品中是不含任何游
15、离甲醛的。25. 图7b是一个核磁共振的甲醛样品比较图,在82ppm处有一个特征峰。26. 图8a是一个系列的荧光光谱强度谱线比较DNA包含控制样本(DNA(控制)和DNA接触被保护剂组合物处理过的样品(“DNA + CF DNA-1”)根据本指导,甲醛(“DNA +0.1% form”)或戊二醛(“DNA + 0.1% 过剩”), 该系列显示样品后在室温下七天(最上一张图 'RT 7天”),在室温下样品后七天之后加热一小时在60度(中间的图:),和样品在室温下放置七天之后加热两分钟在90度(最下的图)。27. 图8b是一个系列的荧光光谱强度谱线比较DNA包含控制样本(DNA(控制)和
16、DNA接触被保护剂组合物处理过的样品(“DNA + CF DNA-1”)根据本指导,甲醛(“DNA +0.1% form”)或戊二醛(“DNA + 0.1% 过剩”), 该系列显示样品后在室温下14天(最上一张图 'RT 14天),在室温下样品后14天之后加热一小时在60度(中间的图:),和样品在室温下放置14天之后加热两分钟在90度(最下的图)。28. 图9a-9c是凝胶电泳图像说明和比较PCR扩增未经处理的DNA(控制DNA);根据本文所教导的处理DNA样品(简记为DNA + CF - dna-bct),采用甲醛处理过的DNA样品(DNA +形式表示)和用戊二醛处理过的DNA样品(
17、DNA +过剩表示)。29. 图10a-10d显示了定量分析结果表明实时聚合酶链反应(PCR)扩增DNA样品通过保护剂组合物(DNA+ cfDNA BCT”)处理,并根据本指导把样品抽取进一个装有保护剂组合物的血液采集装置。甲醛(“DNA + 0.1% 组成”)或戊二醛(“DNA + 0.1%过剩),和比较与未经处理的DNA控制样品(“DNA控制”)。30. 图11显示了定量分析结果表明实时聚合酶链反应(PCR)扩增DNA样品通过保护剂组合物(DNA+ cfDNA BCT”)处理,并根据本指导把样品抽取进一个装有保护剂组合物的血液采集装置。甲醛(“DNA + 0.1% 组成”)或戊二醛(“DN
18、A + 0.1%过剩),和比较与未经处理的DNA控制样品(“DNA控制”)。31. 图12a和12b显示了圆二色光谱说明图天然DNA控制,DNA样品根据本指导被处理,和被甲醛处理过的DNA样品32. 图13a-13d显示了凝胶电泳图片说明一些平行线和比较未经处理的对照样品(记为'自然 DNA”)1,2,8和9)根据本教导用保护剂处理的DNA样本(记为“DNA + cfDNA”;线3,4,10和11)DNA通过IDU处理(记为“DNA + IDU”;线5和12)样品经过甲醛处理(记为DNA + 0.1%”;线6和13),经过戊二醛处理过的样品(记作DNA + 0.1%过剩”;线7和14)
19、33. 图14显示了DNA酶处理血浆对cfDNA浓度的影响34. 图15显示在K3EDTA管储存样品对cfDNA浓度的影响。35. 图16显示了存储在根据本发明的收集装置储存样品对cfDNA浓度的影响36. 图17显示了猝灭步骤的化学方程式。37. 图18显示了一个额外的 猝灭步骤的化学方程式。38. 图19显示了甲醛的释放和通过不同的猝灭剂猝灭。 39. 图20显示了水合甲醛存在不同的淬火剂。40. 图21显示了在不同猝灭剂中的甲醛浓度。 41. 图22显示了水合甲醛释放的化学方程式。 42. 图23显示了甘氨酸/醛混合物的化学形式存在 43. 图24显示了甘氨酸和甲醛在室温下的反应化学方程
20、式 44. 图25显示了甘氨酸和甲醛在50下反应4天的反应化学方程式 45. 图26显示了甲醛的释放和随后的甲醛/甘氨酸反应化学方程式46. 图27显示了猝灭剂和甲醛反应的化学方程式。细节描述47. 除非有别的说明,本文出现的百分数是重量百分比。另外,除非讨论的背景明确做出相反,引用核酸可包括核糖核酸(RNA ),脱氧核糖核酸酸(DNA) ,或各自的片段。比如,讨论游离DNA(cfDNA)不止是指游离DNA,还指DNA片段。48. 本教导考虑非侵入性基因筛选方法来鉴定DNA序列表征,那可能指示各种潜在的病理状况。包括但不限于癌症,神经遗传学疾病,精神障碍,病毒感染,产前诊断,自身免疫性疾病,微
21、嵌合,急性心肌梗死。中风。肠系膜缺血和胰腺炎。本指导不仅保留任何细胞在样品中的形态,还保护游离DNA不受脱氧核糖核酸酶的活性的影响。该教导的方法通常包括以下步骤接触生物样本和不含醛的保护剂组合物在一定的数量和时间,这足以防止1.释放基因组DNA进入到血液样品和2.脱氧核糖核酸活性降解样品内的游离核酸。这个处理充分防止了任何游离醛和样品内的游离核酸反应。核酸的完整性充分保持在其基本状态以避免任何醛的有害影响。因此精确分析样品中的核酸可以被实现。这个方法还包括样品中核酸的分析步骤已按照以上处理。或那些由于种种原因一直接触的保护剂组合物和猝灭剂在其中。如前所述。本教导允许鉴定cfDNA特性在临床上用
22、于预测和诊断应用各种病理的条件。49. 醛基化学品。如甲醛和戊二醛,与各种亲核的细胞成分反应,成型, 例如,羟甲基衍生物的谷胱甘肽的硫醇基和RNA,DNA和蛋白质的氨基。此外。这些醛作为交联剂产生DNA -蛋白质和DNA分子内和分子间的交联,结合的甲醛诱导的DNA在上面修饰可以影响DNA的熔化,DNA 扩大通过聚合酶链反应(PCR)及DNA序列分析。用于遗传研究设计在PCR,这可以导致减少cfDNA浓度和阻碍在甲醛长期固定后,除了荃基固定物在PCR基分析DNA的不利影响外,荧光发射光谱在甲醛固定的非均质性DNA样本,这表现在较低的总荧光信号和伪数据。总体而言,这个工作的主体表明,甲醛可以成功作
23、为一个单元保存而不利于下游分析测量精确cfDNA含量。检测少量的的DNA目标和DNA测序,可能从不利的化学修饰一致的长期固定的生物分子,因此,提高cfDNA浓度的定性和定量在人类的生物流体中,有一个明确的需求关于时间和成本效益的方法,是不含甲醛、保存生物样品的同时保持样品完整性,质量,和cfDNA的特异性分析。50. 本指导预想单一的保护剂组合物可能被使用,包括了防腐剂组合物和猝灭剂。例如保护剂组合物可能被预先装入样品采集装置内,如血液收集管。因此,它可能是从主体直接进入血液收集装置,然后有可能接触保护剂组合物。也可能是从第一个转移到第二个容器,保护剂组合物是现存的。51. 无醛(例如,无甲醛
24、)保护剂组合物可以包括防腐剂等成分可以从以下组中选择:抗氧化剂尿素,咪唑烷基脲,dimethoylol-5,5dimethylhydantoin,二乙基脲,2 -溴- 2- nitropropane-l,二醇。恶唑烷,羟甲基甘氨酸钠,5 hydroxymethoxymethyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3,0,3辛烷,5-hydroxymethyl-l-laza-3,7-dioxabicyclo 3.3.0辛烷,5 hydroxypoly methyleneoxy methyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3.3 .0辛烷或他们的组合。虽然无
25、醛(例如,无甲醛)保护剂组合物可以释放醛(例如,甲醛)本教导的设想一个具体步骤的淬灭醛使其对cfDNA呈现惰性。52. 防腐剂组合物结合猝灭剂有助于保证核酸在样品里避免和自由醛反应,这会造成一个或多个对核酸有害的影响,本指导至少使用一个醛淬灭剂,这是在一个量,足以使任何游离醛(例如,甲醛)从保护剂组合物释放反应形成的反应产物是对生物样品的核酸惰性的。所得的混合物没有任何的醛,样品中的核酸适用于聚合酶链反应和DNA排序,并与自然核酸相比保持结构完整性53. 该防腐剂剂成分的浓度在与样品接触之前可以在这一浓度的DNA和DNA的交联和DNA与蛋白质的交联,并通过琼脂糖凝胶电泳显示。防腐剂成分的浓度在
26、接触样品后大于20mg/ml,10mg/ml,5mg/ml,2mg/ml,或者少于0.8mg/ml在保护剂组合物和生物样品(血液)组成的混合物中。防腐剂的浓度在接触样品之前或之后可能改性取决于诊断程序样品可以接受。例如,浓度可能被改性经过流式细胞仪分析,更具体地说,浓度可能增加进行流式细胞仪分析后。因此,防腐剂成分的浓度在接触样品后可能大于15mg/ml,25mg/ml,或30mg/ml。保护剂组合物的配方可以被改性如样品在经过流式细胞仪分析可以包括DU.保护剂组合物可能包括猝灭剂,保护剂组合物可能包括EDTA。54. 使用的淬灭剂的化合物,包括至少一个官能团能够与甲醛的缺电子性官能团反应,如
27、胺类化合物与甲醛反应生成羟甲基和/ 或亚胺席夫碱或顺式二醇化合物与甲醛反应,形成一个环状缩醛。淬灭剂可以选自氨基酸,烷基胺,多胺,伯胺,仲胺,铵盐或任意组合。淬火剂可以选自甘氨酸,赖氨酸,乙二胺,精氨酸,尿素,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,胞嘧啶:亚精胺。或其任何组合55. 淬灭剂的浓度是一个量足够大,接触样品后随着保护剂组合物。没有游离醛。但是,猝灭剂的浓度是足够小,稀释的样品将不会对任何样品特性的分析产生重大影响的。猝灭剂浓度在接触样品之后可以是高于0.001g/ml,0.002g/ml,0.004g/ml,也可以是低于0.03g/ml,0.01g/ml,或0.008g/ml在保护剂组合物和生物样品(
28、血液)组成的混合物中。56. 本指导假设使用的猝灭剂是甘氨酸与一个或其他猝灭剂的组合物,或者猝灭剂的类型和量的描述和甘氨酸不一样。如猝灭剂可以是任意抗凝血剂和防腐剂成分的组合物用于治疗任何样品中可能含有的游离DNA。(如胎儿游离DNA)57. 在接触一个样品形成的样品和保护剂组成的混合物,保护剂组合物可能会出现在混合物体积的一小部分。在总体积中存在的量应该少于5%,2%,0.5%甚至少于0.3%。保护剂的体积的量在1:20到1:300对应于总混合物。58. 至少在接触步骤中,保护剂的体积的量在1:20到1:300对应于总混合物。比如在接触步骤中,保护剂的体积的量在1:100到1:200对应于总
29、混合物。59. 保护剂组合物可能包括至少一种保护剂组合物从重氮烷基脲,咪唑烷基脲dimethoylol-5,5dimethylhydantoin,二乙基脲,2 -溴- 2- nitropropane-l,二醇。恶唑烷,羟甲基甘氨酸钠,5 hydroxymethoxymethyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3,0,3辛烷,5-hydroxymethyl-l-laza-3,7-dioxabicyclo 3.3.0辛烷,5 hydroxypoly methyleneoxy methyl-l - laza-3。7-dioxabicyclo 3.3 .0辛烷中选择。接触步骤包括
30、采用的保护剂组合物,组合物包括IDU占混合物总重量的0.1%-2.0,可选择的EDTA的量占混合物总重量的约0.05%-0.75,猝灭剂的量足以和任何游离的醛反应,醛的量可能上升从IDU,去形成反应产物生物样品中的任何蛋白质反应。保护剂组合物可以包括20%-60%的咪唑烷基脲,大约1%-10%的猝灭剂,大约1%-20%的EDTA60. 每一个管包含50-400µl的保护剂组合物,每一个管包含100-300µl的保护剂组合物,每一个管包含150-250µl的保护剂组合物,保护剂组合物包含80-100mg的保护剂组合物,1-15mg的猝灭剂,10-25mg的EDTA。
31、在保护剂组合物中,可能包括10份重量的保护剂组合物对应一份重量的猝灭剂,淬灭剂包括至少一个官能团能够与甲醛的缺电子性官能团反应。猝灭剂的成分从氨基酸,烷基胺,多胺,伯胺,仲胺,铵盐或它们的组合中选择。猝灭剂的成分从甘氨酸,赖氨酸,乙二胺,精氨酸,尿素,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,亚精胺,或任何它们的组合中选择,猝灭剂的成分从甘氨酸,赖氨酸,乙二胺,尿素或任何它们的组合中选择。61. 从血浆中分离的cfDNA可能包括分离cfDNA没有任何细胞。分离或分析步骤发生在静脉穿刺至少2小时,7天,14天后。在分离或分析步骤的时候,温度要低于-30,且样品和其组分不能发生冻结。62. 保护剂组合物可选择包括
32、核酸酶抑制剂从以下组分里面选择:焦碳酸二乙酯,乙醇。铝酸(ATA),甲酰胺,氧钒核糖核苷复合物,硅藻土,乙二胺四乙酸(EDTA),蛋白酶K,肝素,羟胺-氧铜离子,膨润土,二硫苏糖醇(DTT)、-巯基乙醇(BME),半胱氨酸,二硫赤藓糖醇,三(2 -羧乙基)光幻视盐酸盐。二价阳离子,如Mg2 +, Mr12 +,2r12+,Fe2+, Ca2 +,Cu2+和其任何组合,保护剂组合物可以包括一种防腐剂组成,醛淬灭剂,和抗凝血药。保护剂组合物可以包括咪唑烷基脲,甘氨酸,乙二胺四乙酸63. 该组合物和方法在此尽可能避免任何在样品中的游离甲醛(或其他的醛),从而有助于避免任何这样的游离甲醛的潜在对核酸的
33、有害影响,该组合物和方法在此可以扩增核酸(例如DNA)根据本教导处理。64. 确定了那一个组合物基本上不含游离醛,尤其是没有的任何游离甲醛(可能是水合甲醛)和/或亚甲基二醇可以使用已知的技术,如通过13C核磁共振(NMR)。组合物本质上完全不含自由醛和/或亚甲基二醇典型的在NMR光谱82-85ppm中没有特征峰。65. 不同浓度的防腐剂组合物淬灭剂可能包含在保护剂组合物可以分析使用13C核磁共振测定减少大量所需游离醛的浓度。更具体地说,各种防腐剂组合物(包括咪唑烷基脲(IDU),(DU),甲醇,甲醛,和oxaban-a(4,4-dimethyl-1,3 -恶唑烷)在不同浓度组合不同浓度的猝灭剂
34、。比如16.7毫克的Gd-DTPA转移到一个空瓶和3.5毫升D2O加入到小瓶。每个样品制备称量15 - 17µl的四氢呋喃转移到空管和四氢呋喃加上管的重量被记录。300µl的样品溶液在水中转移通过添加200µl GD-DTPA / D2O溶液。13C NMR光谱可以捕获。表一是结果。66. 任何确定的化学变化关于DNA双螺旋的形成会发生同样表现使用已知的技术,如光谱法,它可以用于探测的光学现象如荧光。用这个方法,控制样品中的DNA可以被测量跟比较处理过的DNA样品为了确定任何螺旋构象的影响,使用圆二色谱(CD)光谱,根据预测,处理过的样品表现出的CD光谱,与本地的
35、DNA一致。二级结构没有改变的迹象。67. 由此产生的混合物,可以被处理包括一个或多个反应产物包括羟甲基,席夫碱。一个席夫碱猝灭剂交联结构,或一个希夫碱二聚体。对于一个说明性组合物,本指导考虑组成两个或更多的IDU,IDU甘氨酸反应产品,甘氨酸,甘氨酸羟甲基, 甘氨酸希夫碱,甘氨酸交联希夫碱,或希夫碱二聚体。68. 根据本教导处理混合物,可能包括血液细胞没有细胞蛋白质的变性。产生的细胞膜膜内的细胞能够被加工和运输,没有检测到泄漏。因此,样品可能足够完整,游离液体真正准确地代表细胞外流体。进一步说,尽管和一些蛋白(不是核酸)的结合可能发生。结合不是不可逆的,而是通过加热去除,温度可以达到600度
36、到900度。因此本教导也考虑一个可选的步骤的加热处理样品一段时间,温度足以分离蛋白质(比如大约600度到900度)。文中所述加热步骤可以用于净化核酸样本和去除任何核酸样品污染。这样的加热步骤可能是结合使用的蛋白酶可能是丝氨酸蛋白酶,如蛋白酶K。69. 在一个方面:本专利对于变量数据串联重复(VNTR)的分析特别有用。这使得本教导适用于犯罪现场分析,或其他法医DNA分析。在这种情况下,这样的方法成为可能:采用抽取血液样本到一个空的血液收集管中,其中根据本指导包含一个保护剂组合物。相应的血液细胞可以稳定防止其释放核酸,以及猝灭任何自由醛(如。甲醛)。游离DNA可以分离和可选地暴露于一个或多个合适的
37、酶切割DNA区域在VNTRS周围。VNTRS。可以从犯罪现场收集DNA来分析和比较。在亲子鉴定案例测试中,血液抽取方法如上所述可能用于后代和潜在父亲。 聚合酶链反应(PCR)可以用于放大一个样本。产生的放大样品可以被分析,例如,通过合适的光学技术解析样本的光谱。例如,短串联重复(STR)基因座可能是多路复用。还被认定大量的样品未受到保护剂成分的影响。证明存在的缺失变性的STR基因座和交联的缺失位点。此外,由于对组合物长期稳定的影响 (如至少1周,2周,4周或更长时间),它可以在相当长的一段时间使用样品。并避免需要抽取多个血液样本。70. 71. 72. 本指导所考虑的其他应用。包括但不限于提取
38、游离DNA用于检测癌症(包括但不限于癌、白血病或淋巴瘤)。例如,这里的教导也许可以用于检测乳腺癌的异常甲基化,前列腺癌症、胃癌、卵巢癌。结直肠癌。膀胱癌,睾丸癌。食道癌。黑色素瘤或其他癌症。73. 按照本指导,血液样本可以包含一个保护剂组合物,任何醛可以被猝灭, 提取产生的DNA进行分析。分析包括分析DNA的甲基化模式。分析可能是用于确定(如甲基化生物标志物,与一个或多个相关的癌症。神经变性紊乱和/或精神紊乱(如精神分裂症、抑郁症或其他)。例如,分析可能是用于识别发生甲基化胞嘧啶。分析可能是用于检测和/或监测病毒感染、自身免疫性疾病、微嵌合体,急性心肌梗塞、中风、肠系膜缺血和胰腺炎。当然,分析
39、也可能用于产前诊断74. 分析可能采用PCR扩增和检测,质谱分析,并行DNA测序或其他合适的分析技术的一种来检测,,诊断,治疗和/或监控疾病状态或条件。75. 本教导也可能采取措施监测治疗病人的一些治疗的反应(如辐射和/或药物治疗)。血液样本可以在第一时间获取,根据教义处理和DNA分析。血液样本可以在第一时间后一次或多次获取,根据教义处理和DNA分析。各自的分析的结果可能会被比较,治疗可能会改变根据结果的比较。76. 本指导可能进一步被用来保护生物样品在运输和贮藏。运输血液样本从静脉穿刺的地方到另一个设备,通常所需的分子诊断检测。正如文中所讨论的,一些预分析变量可能影响cfDNA测量准确性,包
40、括血液采集设备的选择和样品储存和运输条件。这些参数影响的有核血细胞在静脉穿刺后裂解。有核细胞裂解导致释放gDNA,提升pDNA背景和压制真正cfDNA测量。因此应该尽量减少背景gDNA增加,通常发生在运输和存储是基于样本的移动和温度变化。77. 在运输期间,震动可能会扰乱有核血细胞准确性完整性和妥协,如上所述。在模拟运输条件(使用轨道振动器)在24小时内,血液样本置于K3EDTA和具有保护剂组合物血液采集装置进行比较。在K3EDTA血样观察到在6和24小时pDNA浓度增加。用保护剂组合物稳定的血细胞的pDNA在震动条件下没有表现出相当大的增加。78. 样品运输时,也观察到类似的趋势,当样品被震
41、动。样本运送K3EDTA或保护剂组成血液采集设备比较两管之间pDNA浓度的结果。在运输前后保护剂组合物样本显示稳定pDNA浓度,而K3EDTA显示在运输条件下,pDNA浓度增加。这表明有核细胞裂解导致gDNA释放发生在K3EDTA中的血液样本中, 但这并没有发生在保护剂组合物的样本中。79. 在当前的实践中,血液样本通常用离心来分离血浆和冷冻来防止gDNA污染cfDNA在样品的处理、运输和储存过程中。稳定化学保护剂组合物防gDNA在静脉穿刺0到14天后释放到血浆中。使用血液采集设备透露,来自体内的储存在室温下成为可能,允许灵活装置外抽血送到中央实验室下游分析cfDNA没有初步离心或冷冻保存。8
42、0. 在当前的实践中,血液样本通常通过离心来分离样本可能来自最初的一个或多个生物物质形式。样品可能包括细胞,也可能是不含细胞。一般情况下,样品预计将有一些初步的游离DNA,是要求大幅保持游离DNA和保护的游离DNA从脱氧核糖核酸酶的活动中,以便它可以有效地分析。81. 样品可能在任何数量的方式收集 。他们可能会收集通过静脉穿刺,通过注射器,拭子,放电收集,或其他方面。他们可能会收集在容器(如瓶、样本收集杯,集合管、毛细管或其他)。容器根据本指导可能包括保护剂组合物,样品可能是血液样本,方法可能包括获得新鲜血液样本进入一个空的血液收集管,包括保护剂成分预先放置。82. 方法可能包括一个或多个核酸
43、分析的分析步骤。例如,可能包括一个步骤的方法对样品的定性聚合酶链反应扩增,定量聚合酶链反应扩增在猝灭之后。这个方法可能包括一个步骤的方法对样品的定性聚合酶链反应扩增,定量聚合酶链反应扩增在淬灭步骤发生至少四天,一周或两周后在淬灭步骤之后。该方法可能包括对样品的质谱分析的步骤。方法可能包括一个步骤对样品的质谱至少4天,一个星期。两周在猝灭步骤之后。该方法可能包括对样本DNA测序的步骤。的方法可能包括一个步骤对样本DNA测序发生至少四天,一周或两周在猝灭步骤之后。方法或者可能包括一个步骤对样品进行流式细胞仪分析。83. 本指导与享乐保护剂组合物的范围。单独和/或结合样本收集容器(如空采血设备),包
44、括保护剂组合物(如。在样本收集容器,如血液收集管),其他试剂,聚合酶链反应样本容器(如管)或类似的。 也有利地设想在教导的方法执行聚合酶链反应扩增的一个样品,包括从一个生物样品放大核酸(如脱氧核糖核酸(DNA),按照上面的方法处理。此外,有利地设想确定可变数目串联重复序列的方法(VNTR)DNA样本,包括根据本指导处理样品,确定样本VNTR样本模式,比较第一lrNTR模式从一个已知DNA样品的lrNTR模式,并决定样品VNTR模式是否匹配第一个VNTR模式。84. 本教义均可以用于任何数量的应用,并可用于提高本指导包括基因组大屏幕的胎儿DNA。例如本指导可以找到合适的申请定量实时PCR用于基因
45、识别三体综合症(唐氏综合症),至少有一步检测DNA拷贝数的增加。根据本指导分析样品,一般来说,这可能是在离开临床进行(如一个位置远离产妇抽血的位置(如至少100米,1000米,10000米或更多)。 由于远程特性,通常会有一个步骤运送样品来做临床分析。这样运输可能不需要冷藏。85. 此外,本指导在法医DNA分析提供有用的应用。在放大DNA样本的过程中。放大VNTRs可能集体运行在一个独立的琼脂糖凝胶,它解决了lrNTR DNA片段根据它们的大小和特定主题的(如,犯罪嫌疑人)的已知VNTR模式。定性比较DNA大小的模式在琼脂糖凝胶可以跟在犯罪现场收集DNA样本对比匹配。本教导可能用于获取和保护嫌
46、疑人的血液样本,获取和保护犯罪现场样本,或两者都有。例子86. 血液样本来自健康的捐赠者注入到K3EDTA、血液采集管包含一个防护剂组成。模拟运输条件下,样本晃动或不晃动。样品运输或不运输。评估温度变化。样本在6度,22度和37度培养。在所有情况下血浆是由离心收获和总血浆DNA(pDNA)通过分析定量实时PCR(qPCR)。摇晃K3EDTA管中的血液pDNA大量增加而保护剂组合物的样品没有改变。 血液运输在K3 EDTA管中pDNA增加相比较于那些在保护剂组合物中运输。血液在K3EDTA管中以6度,22度,37度培养时pDNA增加而保护剂组合物中样品的pDNA保持稳定。保护剂组合物可以防止背景
47、gDNA水平的增加在样本存储和运输过程中。因此,保护剂成分提供了一种新颖的方法来获得质量稳定的低丰度的DNA样本目标探测和精确的cfDNA浓度。87. PCR检测游离DNA的目标在一个高gDNA背景是具有挑战性的,需要特殊协议和/或大量的原始材料。因此,从有核细胞最小化释放gDNA对于准确分析真正的cfDNA至关重要。增加背景gDNA不利于检测低丰度cfDNA目标。(图2c)。在7天和14 K3EDTA样品中pDNA浓度增加由于gDNA释放。检测引入SRY片段降低(图2a)。相比之下。含有保护剂组合物管的样品在7天和14天之后pDNA浓度没有显著变化,却发现SRY片段整个时间段内保持稳定(图2
48、 b)。88. 样本储存温度的变化是另一个静脉穿刺条件,可能导致gDNA浓度的变化。三个不同的存储温度对pDNA浓度的影响的血液样本抽取到K3EDTA和保护剂组成物被监控。抽血后,样本在6度,22度,37度培养 14天。K,EDTA血液样本pDNA浓度在6度,22度,37度培养7天和14天后显著变化(图4a)。抽取血液到保护剂组合物管中显示没有任何pDNA浓度的增加, (图4 b)。这说明保护剂组合物稳定pDNA的水平,在广泛的温度范围在较长一段时间防止gDNA释放。89. 招募了一些捐赠者,捐赠者都是男性和女性,都是健康的。所有都使用静脉穿刺经行抽血。对于每一个实验,捐赠血液样本被放入到到两
49、个不同的管。控制样本被抽入K3EDTA管和对照样品放入有保护剂组合物的管。血液立即混合在抽取后通过反复颠倒10次。90. 样品处理91. 静脉穿刺后血液样本被储存在室温下(22度),除非另有声明。对于分离血浆,血液样本在22度300 xg离心20分钟。血浆层小心的移除而不打扰淡白细胞层。使用吸管转移到一个新瓶在22度5000 xg 离心10分钟去除残余细胞。92. 从血浆中分离游离DNA93. 通过提高蛋白酶K在60度持续处理30分钟到1小时.样本在50 UL无菌无核酸酶的水中储存在-80度。直到实时分析qPCR94. 实时定量PCR(qPCR) 95. 96. 储存温度对血液样本中pDNA浓
50、度的影响97. 血液8个捐助者处收集,并注入K3EDTA管和保护剂组合物管。血液样品被等分并分成三组由三份K3EDTA和三份保护剂组合物。每一份储存在6度。,另一组在22度,最后一组在37度 .在每个温度在0天、7和14天获得血浆并储存在-80 度。直到pDNA提取并分析了通过qPCR使用-actin化验。98. 在血液样本中震动和运输对pDNA浓度的影响99. 模拟运输血液来自八个捐助者,抽血到K3EDTA管和保护剂组合物管。管安全的放置在一个摇动平台上,在22度以150rpm的速度摇晃。时间点为0,3,6和24小时,从一个K3EDTA管中提取的血浆和一个从报估计组合物管中提取的血浆在-80
51、度冷冻,直到提取和分析。在一个单独的运输研究中,血液从十个捐助者得来并注入K3EDTA管和保护剂组合物管。管通过4天的运输到实验室并保存在-80度,直到提取和分析。一个管的控制组没有运送,血浆在0和4天获得。对于晃动和运送样品,pDNA通过qPCR使用11-actin化验。100. 统计分析 101. 统计分析的实验室名字.balabalabala102. 保护剂组合物中的化学物质的存在对pDNA扩增的影响 103. 我们调查保护剂组合物对pDNA通过qPCR扩增的影响(图1).血液被抽取到K3EDTA管,血浆被离心分离。血浆上清层被等分为两个治疗组。一组为血浆样本(灰条),添加的保护剂组合物
52、的浓度等于标准10毫升血液。另一组的血浆样品(黑色条)没有经过处理并作为控制。每组样本都经过处理3和6小时(板a)和7和14天(板b)。pDNA浓度测定使用13 -actin qPCR化验。和未经处理的样品相比,样品通过化学物质处理后发现DNA从血浆中提取或其通过qPCR放大没有减少。误差线表明SD ,所有板的n=5。在图1中,比较经过化学处理和未经处理的血浆样本中的pDNA浓度没有减少在22度放大3和6小时培养后。(图1a,p= 0.44,p=0.52);样品培养7和14天显示类似的结果(图1 b、6 p = 0.23,p = 0.003)。这些发现表明防护剂的化学物质成分没有影响DNA从血
53、浆中提取或其通过qPCR放大。 104. 提升血浆中的背景gDNA对检测少见cfDNA序列的影响。 105. 我们模拟gDNA增加浓度的影响。通过-actin化验测量,检测低丰度cfDNA目标通过引入男特征的DNA(SRY)进入到非孕期女性血液(图2)。来自非孕期女性捐赠者的血液进入到K3EDTA管和保护剂组合物管,储存在22度,0,7和14天。在每个时间点,血浆被离心分离。pDNA的构建物包含SRY序列片段 (3000个复制)。总的血浆DNA浓度可以使用-actin qPCR化验来测定(O)和Y染色体序列复制数据是由SRY qPCR化验测定()。对于K3EDTA样本(图2), pDNA在 K
54、3EDTA样品中浓度增加(*p < 0.05, * * p < 0.001),防护剂组成的样本(图28),pDNA浓度保持接近第一天的值(* * p < 0.001)106. 图2显示了在这血浆中的两个基因目标中的的DNA浓度从K3EDTA样本存储在22度 ,0,7和14天。gDNA被释放到血浆中。显著增加gDNA水平通过(13-actin)观察在7和14天的时候,比初始浓度在0天(p = 0.0087,p = 0.0002)。的时候增加。检测的cfDNA目标(SRY基因片段)浓度明显降低(7天,p=0.0068, 14天,p = < 0.0001)。107. 图2 b
55、显示了pDNA浓度在保护剂组合物样本存储在相同的存储条件。血浆从保护剂组合物样本中得到显示13 -actin浓度无显著变化7天,(p=0.55)但在14天时(p=0.0002)。有保护剂组合物时, 剩余gDNA (13 -actin)水平接近第一天的值,cfDNA(SRY基因片段)水平并没有改变,仍可在整个时间进程检测(第七天,p = 0.45和14天,p = 0.20)。 108. 为了更清楚地说明cfDNA目标探测gDNA水平变化的影响,褶皱变化进行计算(图2 c)。由于K3EDTA gDNA水平增加(13 -actin,第七天= 51-褶皱变化)第14天 = 92-褶皱变化),cfDNA
56、检测下降(SRY、第七天= -3-褶皱变化,第14天 = -95-褶皱变化)。保护剂成分gDNA水平保持相对稳定和cfDNA目标探测(SRY、第七天=-1-褶皱变化,第14天 = -1-褶皱变化)。109. 震动和运输对在血液样本中pDNA浓度的影响110. 搅拌条件下呈现在样品运输模拟轨道振动器。控制实验中也使用这两种类型的管而没有震荡(图3)。血样进入K3EDTA管和保护剂组合物管,然后在22度震动0,3,6,24小时。一个K3EDTA管(o)和一个保护剂组成管(a)去除,pDNA被分离。K3EDTA管,受到摇动显示pDNA浓度在3、6和24小时相比时间0显著增加(* p < 0.0
57、5,p < 0.001)。总血浆DNA浓度在震动保护剂组合物样本和没有震动的样本中保持不变。 111. 图3表明,震荡血液进入K3EDTA管导致pDNA浓度显著增加,3、6和24小时在抽血之后(p = 0.03,0.03和0.0003),而震荡血液进入保护剂组合物管显示没有变化(p = 0.14,0.34和0.31)。没有震动控制样本进入K3EDTA、保护剂组合物管的pDNA浓度没有变化3小时(p = 0.14和0.22),6小时(p = 0.33,0.52)或24小时 (p = 0.29,0.29)。 112. 模仿运输后,新样品抽入K3EDTA管或保护剂组合物管。管在22度用4天运输
58、。图3 b说明了在运送K3EDTA和运送保护剂成分样品在返回后pDNA浓度(p=0.01)显著增加。相对于初始值,运送K3EDTA (p = 0.015)和没有运输K3EDTA(p = o.013) pDNA浓度显著增加。而保护剂组合物管的pDNA浓度和初始值比没有变化(p = 0.399和0.340)。 113. 储存温度对在血液样本pDNA浓度的影响114. 抽取血液进入K3EDTA管和保护剂组合物管,样本存储在6度,22度,37度保存0到14天(图4)。血液抽入K3EDTA管和防护剂组合物管。血样等分成三组,每组由3等分 K3EDTA和3 等分保护剂组成。一份在6度(),一份在22度(O
59、)和一份在37度(l)。pDNA浓度测定使用13 -actin qPCR化验。样品进入K3EDTA(图4)和存储温度显示,和0天相比pDNA浓度显著增加, pDNA从保护剂组合物样本中分离出来(图4 b)显示在14天内很小的变化(* p < 0.05,p < 0.001)。115.116. 褶皱变化计算(图4 a和4 b表插图)说明了在K3EDTA管中 pDNA水平在7和14天增加,而保护剂组合物样本pDNA水平变化保持最小。 117. 参照图5、甲醛作为细胞固定剂由于其交联氨基酸的能力,氨基、胍基、硫醇、酚醛。形成DNA-蛋白质交联或DNA-DNA 交联,但重要的是,损伤类型阻碍了遗传。福尔马林诱导交联有效保存DNA结构形态,但它非常不利于后续的DNA分析,因为交联基失速聚合酶和DNA-DN
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